乳酸菌細菌素plantaricin JK的異源表達、分離純化及抗菌活性

蔣 晗，劉 嬌，酈 萍，顧 青，*

(1.浙江工商大學 浙江省食品微生物技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310018； 2.中國計量大學 浙江省海洋食品品質及危害物控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310018)

乳酸菌細菌素plantaricin JK的異源表達、分離純化及抗菌活性

蔣 晗1，2，劉 嬌1，酈 萍1，顧 青1，*

(1.浙江工商大學 浙江省食品微生物技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310018； 2.中國計量大學 浙江省海洋食品品質及危害物控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310018)

為獲得高產雙肽細菌素plantaricin JK，通過PCR擴增獲得plnJ和plnK基因，構建表達載體pET32a(+)-plnJ-BL21(DE3)和pET32a(+)-plnK-BL21(DE3)，經IPTG誘導表達后，利用鎳親和層析柱進行分離純化，重組蛋白經腸激酶酶切純化后，細菌素pln J和pln K的產量分別為2～3、5～8 mg·L-1。利用牛津杯平板抑菌法研究抗菌活性，結果顯示細菌素pln J和pln K對檸檬色葡萄球菌(Staphylococcuscitreus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)和單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)都有明顯抑制作用，且雙肽細菌素plantaricin JK的抑菌圈直徑大于單獨的細菌素pln J或pln K。

plantaricin JK；異源表達；分離純化；抗菌活性

Heterologous expression and purification of plantaricin JK and analysis of its antibacterial

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是美國食品與藥品監督管理局(FDA)認定的食品級微生物，乳酸菌及其代謝產物一般被認為是安全的(generally regarded as safe，GRAS)[1]。乳酸菌細菌素作為一種天然的食品防腐劑，其原始產生菌對細菌素具有自身免疫性，又因為其本質為蛋白質或多肽，所以能夠被胃腸道內的蛋白酶降解，具有高效、無毒、無殘留、無抗藥性、耐酸、耐高溫等特點，受到各國科學家的關注[2-3]。目前，已在乳球菌、片球菌、雙歧桿菌、腸球菌、明串珠菌、鏈球菌、肉食桿菌、乳桿菌等8屬的乳酸菌中發現40多種乳酸菌細菌素[4]。

筆者所在實驗室團隊從健康嬰兒糞便中篩選到1株具有良好抑菌活性的新型植物乳桿菌(Lactobacillμsplantarum) ZJ316，經全基因組測序，發現其基因簇中含有編碼二肽細菌素plantaricin JK的基因plnJ和plnK[5]。天然plantaricin JK的分離純化方法復雜，表達困難且產量很低，不利于大規模生產和后續深入研究，化學合成細菌素效率高，可用作深入研究，但成本太高不利于市場應用；而異源表達在提高細菌素產量上提供了新的可能。在所有的表達宿主中，大腸埃希菌(Escherichiacoli)被認為是遺傳背景最清楚、表達系統最成熟完善的基因工程菌。Plantaricin JK屬于Class Ⅱb類細菌素，少有翻譯后修飾，是基因工程技術的主要研究對象。本研究擬以細菌素pln J和pln K為研究對象，通過基因工程手段將其在E.coliBL21 (DE3)中表達，形成帶His標簽的融合蛋白，經鎳柱純化和腸激酶酶切分離純化后，再采用RT-HPLC純化，獲得高產高純并有抑菌活性的雙肽細菌素plantaricin JK，為其作為生物防腐劑投入市場提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與載體

宿主菌E.coliDH5α購自寶生物工程(大連)有限公司，E.coliBL21 (DE3)購自New England Biolabs (NEB，USA)公司。克隆載體pUC57和表達載體pET 32a(+)購自美國Novagen公司。抗菌活性檢測菌株藤黃微球菌(Micrococcusluteus)，檸檬色葡萄球菌(Staphylococcuscitreus)，單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和大腸埃希菌(E.coli)均為本實驗室保存。

1.1.2 主要儀器

蛋白質快速純化系統AKTA purifier 100，GE；蛋白質垂直電泳系統，Bio-Rad；臺式高速冷凍離心機3K30，Sigma；恒溫振蕩器 DHZ-C-1，太倉市實驗設備廠；超凈臺SW-CJ-2FD，上海博迅；高壓細胞破碎儀AH-1500，德國力士樂。

1.1.3 主要試劑

DNA電泳和蛋白電泳所需試劑均購自生工生物工程(上海)有限公司。PCR試劑購自Takara公司。SanPrep 柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)有限公司。腸激酶購自英國New England Biolabs (NEB)公司。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因片段設計與合成

基因片段plnJ和plnK的序列來自于實驗室分離的植物乳桿菌ZJ316，去除前導序列，添加1個腸激酶位點(用斜體表示)(5’-GATGATGATGATAAA-3’)和2個限制性內切酶位點(用下劃線表示)——KpnⅠ(-GGTACC-)，NcoⅠ(-CCATGG-)，兩端最后加入保護堿基，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。完整序列如下。

plnJ: CGGGGTACCGATGATGATGATAAAGG-CGCTTGGAAAAATTTCTGGTCTAGTTTAAGAAAA-GGATTTTATGATGGCGAAGCTGGCAGAGCAATC-CGTCGTTAACCATGGCATG；plnK: CGGGGTACCGATGATGATGATAAACG-TCGGAGTCGTAAAAATGGAATTGGATACGCTAT-TGGTTATGCGTTTGGCGCGGTTGAACGGGCCGT-GCTTGGTGGTTCAAGGGATTATAATAAGTGACC-ATGGCATG。

1.2.2 引物設計及 PCR擴增

根據合成的堿基序列設計相應引物。KpnⅠ和NcoⅠ酶切位點用下劃線表示。plnJ的引物：P1，5’-CGGGGTACCGATGATGATGATAAAGGC-3’；P2，5’-CATGCCATGGTTAACGACGGATTG-3’。plnK的引物：P3，5’-CGGGGTACCGATGATGATGATAAAC-3’；P4，5’-CATGCCATGGT CACTTATTATAATCCC-3’。PCR擴增體系(50 μL): PrimeSTAR HS DNApolymerase 0.5 μL，5×PS buffer (Mg2+plus) 10 μL，dNTPs (10 mmol·L-1)4 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，模板DNA 1.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測分子量和純度。

1.2.3 原核表達載體構建

PCR 產物與pET 32a(+)質粒分別進行KpnⅠ和NcoⅠ雙酶切，酶切產物純化回收，經T4-DNA連接酶16 ℃過夜連接，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，涂布于氨芐抗性瓊脂平板，37 ℃過夜培養，選擇陽性克隆菌株轉化至表達菌株E.coliBL21 (DE3)，再次涂布于氨芐抗性瓊脂平板，37 ℃過夜培養，選擇陽性克隆菌株進行菌落PCR鑒定，提取質粒進行KpnⅠ和NcoⅠ雙酶切鑒定，后將陽性克隆送至生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.4 融合蛋白表達

重組菌株pET32a(+)-plnJ-BL21(DE3)和pET32a(+)-plnK-BL21(DE3)分別以1%的接種量接種至50 mL LB液體培養基(含氨芐)中， 200 r·min-1，37 ℃過夜培養。將新鮮菌液以1%的接種量轉接至2 L的LB液體培養基(含氨芐)中，200 r·min-1，37 ℃培養至菌液D600達到0.6～0.8時，向培養基中添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D- thiogalactoside，IPTG)，終濃度為1 mmol·L-1，140 r·min-1，18 ℃搖床誘導16 h。將過夜誘導的菌液8 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀，-20 ℃備用。將收集的菌體沉淀用少量PBS緩沖液(pH為7.4)洗滌，4 ℃，8 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀，然后按照每100 mL培養基所得菌體10 mL緩沖液的比例加入預冷的PBS緩沖液重懸細胞。菌體懸液通過超高壓破碎系統進行細胞破碎，800 MPa重復破碎3次，此時菌懸液基本澄清。以4 ℃、10 000 r·min-1、20 min的條件對菌懸液進行離心。此時可溶性表達的蛋白存在于上清中。收集上清，經SDS-PAGE鑒定后用于后期的親和純化。

1.2.5 融合蛋白親和純化

利用5 mL HisTrap HP預裝柱和AKTA Purifier蛋白純化儀進行蛋白純化。所有樣品液采用0.22 μm一次性針頭式過濾器過濾。結合緩沖液包含20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1氯化鈉，10 mmol·L-1咪唑，用HCl調節pH至8.0；洗脫緩沖液包含20 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1氯化鈉，500 mmol·L-1咪唑，用HCl調節pH至8.0。HisTrap預裝鎳柱以10倍柱體積的超純水和結合緩沖液清洗后，洗脫緩沖液以10%～100%的梯度，流速0.5 mL·min-1洗脫目標蛋白，每5 mL收集1管。洗脫緩沖液100%洗脫完后，繼續跑3～5個柱體積。之后采用100%結合緩沖液、超純水沖洗管路，最后以20%乙醇沖洗管路，保存HisTrap HP預裝柱。收集與洗脫峰對應的收集管溶液，進行SDS-PAGE檢驗，將目標蛋白于-4 ℃冷藏暫存。

1.2.6 融合蛋白腸激酶酶切

利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定重組蛋白濃度。利用腸激酶對重組蛋白進行酶切，13 ℃過夜酶切 16 h。采用規格為15 mL、濾膜孔徑大小為10 ku的超濾離心管對酶切產物進行初步分離，離心條件為4 ℃，4 800g，60 min。離心后下層濾液中含有目標細菌素片段。

1.2.7 pln J和pln K抑菌活性測定

將冷凍干燥得到的細菌素pln J和pln K以0.05%乙酸溶解，終濃度為20 μmol·L-1。利用瓊脂擴散實驗[6]研究單獨的pln J或pln K及plantaricin JK的抗菌效果，指示菌分別為檸檬色葡萄球菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌和單核細胞增生李斯特菌。

2 結果與分析

2.1plnJ和plnK基因的合成及擴增

plnJ和plnK的基因PCR擴增結果如圖1所示，擴增片段大小均在100～200 bp之間，與理論值基本相符，陰性對照則沒有出現特異性片段。

2.2 原核表達質粒鑒定

重組質粒轉化表達菌株E.coliBL21(DE3)后，在氨芐抗性平板上篩選出陽性轉化子。轉化子在含有氨芐的LB培養基培養后，取適量菌液作模板，進行菌液PCR驗證，PCR產物片段大小與理論值基本相符(圖2)。將陽性轉化子測序，測序結果與目標基因序列一致。

2.3 融合蛋白的表達和鎳柱親和純化

對重組菌株pET32a(+)-plnJ-BL21(DE3)和pET32a(+)-plnK-BL21(DE3)進行IPTG誘導表達及鎳柱親和純化，并做SDS-PAGE鑒定。如圖3所示，與未誘導的重組菌株相比，誘導后重組菌株表達出目的蛋白條帶。理論上，Trx-His6-pln J和Trx-His6-pln K的大小分別為22.7和23.5 ku，圖3中的目的蛋白條帶均與理論值相符。經鎳柱親和純化后的融合蛋白與未純化時相比，條帶較為單一，雜質已基本去除。

M，分子量標記；泳道1～2，pln J基因片段；泳道3，不加DNA模板的陰性對照；泳道4～5，pln K基因片段；泳道6，不加DNA模板的陰性對照M， Marker; Lane 1-2， Gene fragments of pln J; Lane 3， Negative control; Lane 4-5， Gene fragments of pln K; Lane 6， Negative control圖1 pln J和 pln K基因片段的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of pln J and pln K genefragments

M，分子量標記；A 中泳道1～3，pln J陽性轉化子菌液PCR結果；B中泳道1～5，pln K陽性轉化子PCR驗證結果；B中泳道6為陰性對照M， Marker; Lane 1-3 in part A， PCR result of positive transformants of pln J; Lane 1-5 in part B， PCR result of positive transformants of pln K; Lane 6 in part B， Negative control圖2 重組質粒菌液PCR驗證Fig.2 Bacterial PCR amplification result of recombinantplasmids

2.4 融合蛋白的腸激酶酶切

利用BCA蛋白濃度測定試劑盒及標準曲線計算出濃縮后的重組蛋白Trx-His6-pln J和Trx-His6-pln K的濃度分別為2.46和3.17 mg·mL-1。按說明書要求計算，1 mL Trx-His6-pln J需用腸激酶7.88 μL，1 mL Trx-His6-pln K需用腸激酶10.14 μL。

圖4是Trx-His6-pln J和Trx-His6-pln K酶切的Tricine-SDS-PAGE鑒定結果，在4 ku附近均有條帶，與pln J和pln K的理論大小4.6和3.5 ku相符。但pln J的條帶顏色較淺，表明經鎳柱親和純化和腸激酶切割融合標簽后，損失較大。

2.5 異源表達plantaricin JK的抑菌活性鑒定

以實驗室保存的4株菌為指示菌，用終濃度為20 μmol·L-1的pln J、pln K和以pln J、pln K等摩爾混合的plantaricin JK進行瓊脂擴散實驗，以0.05%乙酸為陰性對照(CK)，檢測并比較其抑菌活性。抑菌圈的評價標準是直徑和透明度，越大越透明說明抑菌效果越好。結果如圖5所示：陰性對照對各指標菌均無抑菌活性；單獨的細菌素pln J或pln K對大腸埃希菌均有一定的抑菌效果，兩者混合得到的雙肽細菌素plantaricin JK條件下，抑菌圈變大，說明抑菌效果增強(圖5-A)；單獨的細菌素pln J或pln K對單核細胞增生李斯特菌均有一定的抑菌效果，兩者混合得到的雙肽細菌素plantaricin JK條件下，抑菌圈略變大，圈變得更透明，說明抑菌效果增強(圖5-B)；在檸檬色葡萄球菌(圖5-C)和藤黃微球菌(圖5-D)上的試驗結果與在大腸埃希菌、單核細胞增生李斯特菌上相似。由此推斷，異源表達的pln J 和pln K仍能保持較好的抑菌活性，且等摩爾比混合后，存在一定的協同作用。

A 中：M，蛋白質量標記；泳道1，Trx-His6-pln J誘導前的總蛋白；泳道2，Trx-His6-pln J誘導后的總蛋白；泳道3，Trx-His6-Pln J可溶性蛋白；泳道4，鎳柱純化的穿透峰；泳道5～7，鎳柱純化的洗脫峰，即Trx-His6-pln J 目標條帶。B 中：M，蛋白質量標記；泳道1，Trx-His6-pln K誘導前的總蛋白；泳道2，Trx-His6-pln K誘導后的總蛋白；泳道 3～4，Trx-His6-pln K可溶性蛋白；泳道5，鎳柱純化的穿透峰；泳道6～7，鎳柱純化的洗脫峰，即Trx-His6-pln K目標條帶A: M， Marker; Lane 1， Trx-His6-pln J before induction; Lane 2; Trx-His6-pln J after induction; Lane 3， Trx-His6-pln J soluble fractions; Lane 4， Binding buffer washed proteins; Lane 5-7， Target Trx-His6-pln J. B: M， Marker; Lane 1， Trx-His6-pln K before induction; Lane 2; Trx-His6-pln K after induction; Lane 3-4， Trx-His6-pln K soluble fractions; Lane 5， Binding buffer washed proteins; Lane 6-7， Target Trx-His6-pln K圖3 重組融合蛋白的表達純化及SDS-PAGE鑒定Fig.3 Identification of expression and purification of recombinant fusion protein by SDS-PAGE

A中：M，蛋白質量標記；泳道1，未進行腸激酶酶切的Trx-His6-pln J融合蛋白；泳道2～3，腸激酶酶切后的Trx-His6-pln J融合蛋白。B中：M，蛋白質量標記；泳道1，未進行腸激酶酶切的Trx-His6-pln K融合蛋白；泳道2～3，腸激酶酶切后的Trx-His6-pln K融合蛋白A: M， Marker; Lane 1， Trx-His6-pln J fusion before enterokinase cleavage; Lane 2-3， Trx-His6-pln J fusion after enterokinase cleavage. B: M， Marker; Lane 1， Trx-His6-pln K fusion before enterokinase cleavage; Lane 2-3， Trx-His6-pln K fusion after enterokinase cleavage圖4 Trx-His6-pln J和 Trx-His6-pln K的腸激酶酶切Fig.4 Cleavage of enterokinase of fusion protein Trx-His6-pln J and Trx-His6-pln K

A，大腸埃希菌；B，單核細胞增生李斯特菌；C，檸檬色葡萄球菌；D，藤黃微球菌A， Escherichia coli; B， Listeria monocytogenes; C， Staphylococcus citreus; D， Micrococcus luteus圖5 細菌素plantaricin JK對4種指示菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial activities of plantaricin JK against 4 indicator strains

3 討論

乳酸菌細菌素在食品防腐保鮮、飼料和醫療中的應用研究均有報道[7-9]，其中Nisin更是成為FDA認證的已大量投入商業使用的乳酸菌細菌素[10]。通過傳統分離純化手段獲得細菌素的得率很低，化學合成細菌素工業化生產成本較高。基因工程技術近幾年的飛速發展使這個問題有望解決。Pediocin PA-1是最常被用于異源表達的乳酸菌細菌素，Beaulieu等[11]利用大腸埃希菌基因工程菌和Thioredoxin(Trx)標簽以及腸激酶酶切位點，最終得到有活性的純化蛋白，含量達到10 mg·L-1。亦有研究利用大腸埃希菌構建基因工程菌進行異源表達，得到能夠抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的Plantaricin Pln1，得率為9～11 mg·L-1[12]。二肽細菌素Plantaricin EF通過異源表達，得率在1～1.5 mg·L-1[13]。Plantaricin JK是Class Ⅱb類乳酸菌細菌素，由位于同一個操縱子的2個基因編碼的寡肽pln J和pln K組成，可利用2條寡肽的協同作用抑制多種細菌，是潛在的天然食品防腐劑和抗生素替代品[14]。本研究通過基因工程手段成功在E.coliBL21 (DE3) 中實現pln J和pln K的異源表達，形成帶His標簽的可溶性融合蛋白，經鎳柱純化和腸激酶酶切純化后，pln J的產量為每升培養基2～3 mg，pln K的產量為每升培養基5～8 mg。經抗菌活性實驗可知，異源表達的plantaricin JK也有很好的抑菌活性，且pln J與pln K存在一定的協同作用。若能在今后的研究中進一步優化分離純化方法，將有良好的市場應用前景。

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(責任編輯 高 峻)

activity

JIANG Han1，2， LIU Jiao1， LI Ping1， GU Qing1，*

(1.KeyLaboratoryforFoodMicrobialTechnologyofZhejiangProvince，ZhejiangGongshangUniversity，Hangzhou310018，China; 2.KeyLaboratoryofMarineFoodQualityandHazardControllingTechnologyofZhejiangProvince，ChinaJiliangUniversity，Hangzhou310018，China)

In order to obtain the high-yield two-peptide bacteriocin plantaricin JK， pln J and pln K were successfully heterologously expressed inEscherichiacoliBL21 (DE3)， and were induced by IPTG. Then the two peptides were expressed as His6-tag fusion proteins and were separated by Ni2+chelating affinity chromatography. The fusion proteins were cleaved by enterokinase and further purified. The yields of pln J and pln K were around 2-3 and 5-8 mg·L-1. The antibacterial activity of the peptides against 4 indicator strains， i.e.Staphylococcuscitreus，Escherichiacoli，Micrococcusluteus，Listeriamonocytogenes， was analyzed by agar diffusion method. It was shown that pln J and pln K both could inhibit the growth of the 4 indicator strains， but plantaricin JK had larger inhibition zone than pln J or pln K alone.

plantaricin JK; heterologous expression; expression and purification; antibacterial activity

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.21

2016-12-12

國家國際科技合作專項(2013DFA32330)；國家自然科學基金項目(31540044，31271821)；國家高技術研究發展計劃(863計劃) (2014AA022210-08)

蔣晗(1987—)，女，浙江杭州人，博士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail: jianghan825@126.com

*通信作者，顧青，E-mail: guqing2002@hotmail.com

Q786

A

1004-1524(2017)02-0332-06