高效液相色譜法測(cè)定芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)

潘星燕，陸云霞，姚 軍,2

(1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河北石家莊 050018)

高效液相色譜法測(cè)定芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)

潘星燕1，陸云霞1，姚 軍1,2

(1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河北石家莊 050018)

為建立測(cè)定芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)的方法，采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent HC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀，流速為0.8 mL/min，按照梯度洗脫，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果表明：主藥與各雜質(zhì)、各雜質(zhì)之間分離度良好，各雜質(zhì)均能被有效檢出；芒柄花素磺酸鈉及雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)和G的質(zhì)量濃度分別在0.060～4.004(r=0.999 8)，0.056～3.756(r=0.999 3)，0.039～3.902(r=0.999 6)，0.060～4.026(r=0.999 5)，0.058～3.878(r=0.999 3)，0.058～3.869(r=0.999 5)，0.060～3.977(r=0.999 5)和0.040～3.952 μg/mL(r=0.999 4)范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系；儀器精密度、中間精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值小于2.0%；各雜質(zhì)測(cè)定的平均回收率為98.49%～101.76%，RSD值為0.37%～1.37%(n=9)。本方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、耐用性良好，可用于芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

色譜分析；芒柄花素磺酸鈉；高效液相色譜法；梯度洗脫；有關(guān)物質(zhì)

芒柄花素磺酸鈉為天然異黃酮經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后的全新化合物[1]，是具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)家Ⅰ類新藥，在心腦血管中的藥理活性已通過(guò)藥理藥效學(xué)試驗(yàn)并得到了很好的證實(shí)[2-4]。已完成的安全性評(píng)價(jià)研究證明，芒柄花素磺酸鈉的毒副作用小，安全性優(yōu)于其他溶栓藥和抗血栓藥[5-6]。芒柄花素磺酸鈉為臨床治療心腦血管疾病提供了一種新的選擇，具有良好的市場(chǎng)前景。

芒柄花素磺酸鈉為臨床治療缺血性腦中風(fēng)提供了一種新的選擇，具有良好的市場(chǎng)前景，對(duì)其有關(guān)物質(zhì)的研究具有重要的意義。目前，只有高效液相色譜法測(cè)定芒柄花素含量[7-11]。為規(guī)范該候選藥物的臨床前研究，為臨床實(shí)驗(yàn)提供質(zhì)量可控的大量樣品，本研究對(duì)其有關(guān)物質(zhì)的分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究，采用高效液相色譜(HPLC)法，以對(duì)甲氧基苯乙酸和間苯二酚為起始物料，合成過(guò)程共3個(gè)步驟[12-13]，產(chǎn)生的副產(chǎn)物及中間體共有7種雜質(zhì)[14]，各雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 芒柄花素有關(guān)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)
Fig.1 Chemical structure of formononetin related impurities

1 主要儀器與試藥

1.1 主要儀器

2695-2996型HPLC儀，包括2695分離單元、2996二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司提供)；XA-105U型電子分析天平(梅特勒-托利多公司提供)。

1.2 試劑與藥品

芒柄花素磺酸鈉(自制，批號(hào)分別為160301，160501，160502和160503，純度分別為98.38%，98.31%，98.22%和98.43%)；芒柄花素磺酸鈉對(duì)照品(自制，批號(hào)為DZ160301，純度為98.89%)；雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G對(duì)照品(自制，批號(hào)分別為Z16031，Z16032，Z16033，Z16034，Z16035，Z16036和Z16037，純度分別為92.88%，97.54%，99.61%，95.43%，96.16%，98.54%和97.84%)；乙腈，色譜純；磷酸二氫鉀，氫氧化鈉，均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液；采用梯度洗脫(0～10 min，25%A→32%A；10～28 min，32%A→78%A；28～45 min，78%A；45～50 min，78%A→25%A；50～60 min，25%A)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液配制

1)供試品溶液 精密稱取芒柄花素磺酸鈉(批號(hào)為160501)適量，加入空白溶劑溶解并稀釋，制成1 mL約含芒柄花素磺酸鈉0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。

2)對(duì)照品溶液 精密稱取芒柄花素磺酸鈉(批號(hào)為DZ160301)適量，加空白溶劑溶解并稀釋，制成1 mL約含芒柄花素磺酸鈉0.4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

3)對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，置于200 mL容量瓶中，加入空白溶劑并稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照溶液。

4)雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液 精密稱取雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G對(duì)照品各適量，分別用空白溶劑溶解，制成1 mL中含相應(yīng)雜質(zhì)約0.1 mg的溶液，作為各雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液。

5)雜質(zhì)對(duì)照品溶液 精密量取上述雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液各1 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用空白溶劑溶解并制成1 mL中含雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G約為2.0 μg的溶液，作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

6)系統(tǒng)適用液 精密稱定芒柄花素磺酸鈉20 mg，精密量取上述雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液各1 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用空白溶劑溶解，制成1 mL中含有雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G約為2.0 μg，含芒柄花素磺酸鈉約0.4 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用液。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖
Fig.2 HPLC chromatogram of system suitability test

7)空白溶劑 甲醇-水(1︰1，體積比)，作為空白溶劑。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下空白溶劑、供試品溶液和系統(tǒng)適用液各10 μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。

圖2結(jié)果表明，空白溶劑不干擾芒柄花素磺酸鈉有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，各雜質(zhì)及芒柄花素磺酸鈉之間能夠達(dá)到基線分離。各雜質(zhì)相對(duì)于主成分的相對(duì)保留時(shí)間詳見(jiàn)表1。

表1 各雜質(zhì)相對(duì)于主成分的相對(duì)保留時(shí)間

2.3.2 專屬性試驗(yàn)

1)酸破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號(hào)為160501)約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL溶解，于60 ℃水浴條件下放置2 h后取出，放冷，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL中和，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞溶液。

2)堿破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號(hào)為160501)約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL溶解，室溫放置10 min后，加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL中和，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液。

3)氧化破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號(hào)為160501)約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水溶液1 mL溶解，室溫放置1 h后，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液。

4)高溫(固體)破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號(hào)為160501)適量，置于稱量瓶中，于80 ℃條件下放置24 h后取出，放冷，精密稱定10 mg，置于25 mL量瓶中，加空白溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為高溫(固體)破壞溶液。

5)光照破壞 取芒柄花素磺酸鈉(批號(hào)為160501)適量，置于稱量瓶中，在光照度為(4 500±500)lx的條件下照射48 h后取出，精密稱定10 mg，置于25 mL量瓶中，加空白溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為光照破壞溶液。分別量取10 μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖，結(jié)果詳見(jiàn)圖3。

圖3 專屬性試驗(yàn)色譜圖
Fig.3 Chromatograms of specificity test

結(jié)果表明，芒柄花素磺酸鈉在酸、氧化、高溫、光照破壞條件下穩(wěn)定，不降解；堿破壞后，各降解產(chǎn)物與主峰能夠良好地分離，且能與各個(gè)雜質(zhì)達(dá)到基線分離，說(shuō)明本方法的專屬性良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”項(xiàng)下芒柄花素磺酸鈉對(duì)照品溶液和各雜質(zhì)的對(duì)照品溶液適量，分別用空白溶劑進(jìn)行稀釋，制成一系列濃度的線性試驗(yàn)溶液。分別精密量取10 μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。線性試驗(yàn)溶液質(zhì)量濃度、回歸方程及校正因子詳見(jiàn)表2。

表2 線性試驗(yàn)溶液質(zhì)量濃度、回歸方程及校正因子

2.3.4 檢測(cè)限與定量限

分別取“2.2”項(xiàng)下芒柄花素磺酸鈉對(duì)照品溶液和各雜質(zhì)對(duì)照品溶液適量，進(jìn)行逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣。當(dāng)峰高

約為基線噪音的10倍時(shí)測(cè)得定量限，當(dāng)峰高約為基線噪音的3倍時(shí)測(cè)得檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.5 儀器精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下芒柄花素磺酸鈉對(duì)照溶液，精密量取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果得知，芒柄花素磺酸鈉峰面積的RSD值為1.1%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取芒柄花素磺酸鈉適量，精密稱定，加空白溶劑溶解并稀釋制成1mL中含有芒柄花素磺酸鈉0.4mg的溶液，平行配制6個(gè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果得知，芒柄花素磺酸鈉峰面積的RSD值為1.2%。

表3 檢測(cè)限與定量限考察結(jié)果

2.3.7 中間精密度試驗(yàn)

按“2.3.6”項(xiàng)下方法，另配制6個(gè)供試品溶液，由不同的分析人員，在不同的日期、使用不同的儀器進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果得知，重復(fù)性與中間精密度共12次進(jìn)樣的RSD值為1.7%，說(shuō)明本方法的中間精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液及雜質(zhì)對(duì)照品溶液，于室溫放置0，2，4，8，12，24，36，48h，分別精密量取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果得知，供試品溶液主峰面積的RSD值為1.24%(n=8)，各雜質(zhì)峰面積的RSD值分別為1.68%，1.35%，1.44%，1.48%，1.45%，1.40%和1.38%(n=8)，說(shuō)明供試品溶液及雜質(zhì)對(duì)照品溶液在室溫條件下放置48h是穩(wěn)定的。

2.3.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取芒柄花素磺酸鈉供試品10份(每份約20mg，置于10個(gè)不同的50mL量瓶中)，其中1份加空白溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，作為供試品溶液；另外9份中分別加入“2.2”項(xiàng)下雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液各0.8mL×3，1.0mL×3，1.2mL×3，加空白溶劑制成不同濃度的供試品溶液。分別精密量取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

注：-表示未檢出。

2.3.10 耐用性試驗(yàn)

改變有關(guān)物質(zhì)測(cè)定色譜條件中的柱溫(±2 ℃)、流速(±0.1mL/min)、波長(zhǎng)(±2nm)、pH值(±0.2)和色譜柱(不同批次)，分別測(cè)定同一批樣品。結(jié)果表明，雜質(zhì)測(cè)得量基本不變，雜質(zhì)個(gè)數(shù)也無(wú)變化。這說(shuō)明本方法的耐用性良好。

2.4 樣品測(cè)定

取4批樣品適量，分別按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。已知雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)和G采用相對(duì)保留時(shí)間定位，所含各雜質(zhì)采用自身對(duì)照法，按校正后的峰面積(分別乘以校正因子)進(jìn)行計(jì)算。供試品中如有已知雜質(zhì)峰，則均不得大于對(duì)照溶液主峰面積，其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積亦不得大于對(duì)照溶液的主峰面積，各雜質(zhì)校正后峰面積之和不得大于對(duì)照主峰面積的2倍。樣品有關(guān)物質(zhì)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

注：-表示未檢出。

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

前期試驗(yàn)中，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，采用甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀(二者體積比為20∶80)為流動(dòng)相時(shí)，雜質(zhì)不能全部檢出。為此將等度洗脫變?yōu)樘荻认疵摚l(fā)現(xiàn)雜質(zhì)B與雜質(zhì)F的分離度不符合要求。為改善雜質(zhì)B與雜質(zhì)F的分離度，將甲醇更換為洗脫能力更強(qiáng)的乙腈，同時(shí)調(diào)節(jié)乙腈的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩雜質(zhì)的分離度滿足要求，主成分峰的峰形良好，理論塔板數(shù)較高。按照此梯度條件，將磷酸二氫鉀濃度變?yōu)?.005mol/L，雜質(zhì)D與雜質(zhì)B的拖尾因子分別為1.994和2.331，不符合要求，故緩沖鹽的濃度不宜再降低。此檢測(cè)方法主成分峰與各雜質(zhì)峰均能實(shí)現(xiàn)有效分離，破壞試驗(yàn)中的降解雜質(zhì)不影響芒柄花素磺酸鈉雜質(zhì)的測(cè)定。

3.2 色譜柱的選擇

分別對(duì)安捷倫公司AgilentHC-C18柱、AgilentTC-C18柱、Thermo-Fisher公司HypersilBDSC18柱(規(guī)格均為250mm×4.6mm，5μm)共3根色譜柱進(jìn)行考察。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，3根色譜柱對(duì)主成分及雜質(zhì)均能良好分離。

3.3 校正因子和雜質(zhì)計(jì)算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值計(jì)算得出各雜質(zhì)相對(duì)于主成分的校正因子[18-19]。雜質(zhì)的計(jì)算采用加入校正因子的自身對(duì)照法[20]，既可以解決雜質(zhì)對(duì)照品獲取難的問(wèn)題，又可計(jì)算出產(chǎn)品中雜質(zhì)的真實(shí)含量。

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究建立的高效液相色譜法專屬性強(qiáng)，精密度、準(zhǔn)確度和耐用性良好，可有效檢出芒柄花素磺酸鈉中的有關(guān)物質(zhì)，為芒柄花素磺酸鈉的質(zhì)量控制提供了重要依據(jù)。由于部分雜質(zhì)的對(duì)照品有限，故只采用了加入校正因子主成分自身對(duì)照法來(lái)控制原料藥中雜質(zhì)的含量，而沒(méi)有采用定量更為準(zhǔn)確的外標(biāo)法。今后還需要對(duì)芒柄花素磺酸鈉的后期穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究。

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Related substance determination of formononetin by HPLC

PAN Xingyan1, LU Yunxia1, YAO Jun1,2

(1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2.State Key Laboratory Breeding Base-Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug of Hebei Province, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

To establish a method for the related substance determination of formononetin, HPLC is performed on the column of Agilent HC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm) with the mobile phase A of acetonitrile and mobile phase B of potassium dihydrogen phosphate solution at the flow rate of 0.8 mL/min. According to gradient elute, the sample size is 10 μL, the detection wavelength is 250 nm, and the column temperature is 30 ℃. The result shows that the main drug and related substances could be well separated and detected effectively, different impurities can be detected effectively, and there is a good linear relationship between the mass concentration of formononetin and impurity A, B, C, D, E, F and G and peak area in the range of 0.060～4.004 μg/mL(r=0.999 8), 0.056～3.756 μg/mL(r=0.999 3), 0.039～3.902 μg/mL(r=0.999 6), 0.060～4.026 μg/mL(r=0.999 5), 0.058～3.878 μg/mL(r=0.999 3), 0.058～3.869 μg/mL(r=0.999 5), 0.060～3.977 μg/mL(r=0.999 5) and 0.040～3.952 μg/mL(r=0.999 4), respectively. The RSD of instrument precision, intermediate precision and stability test is no more than 2.0%, and the average recovery of impurities is in the range of 98.49%～101.76% with the RSD in the range of 0.37%～1.37%(n=9). The method is simple, reliable and accurate, and can be used to detect related substance in sodium formononetin-3'-sulfonate.

chromatography；formononetin；HPLC；gradient elute；related substances

1008-1542(2017)01-0032-07

10.7535/hbkd.2017yx01006

2016-11-04；

2016-12-12；責(zé)任編輯：張士瑩

科技部重大專項(xiàng)(2013ZX09103001-002)

潘星燕(1991—)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事藥物分析方面的研究。

姚 軍教授。E-mail：twobright@163.com

R917

A

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