地中海貧血實驗室診斷技術進展

蒙紹建

（廣西馬山縣婦幼保健院檢驗科，廣西 南寧 530699）

地中海貧血實驗室診斷技術進展

蒙紹建

（廣西馬山縣婦幼保健院檢驗科，廣西 南寧 530699）

地中海貧血是一類以α或β珠蛋白鏈合成障礙為特征的溶血性貧血病，是人類最常見的單基因遺傳病之一。臨床為了提高地中海貧血的診斷準確率，降低漏診以及誤診情況，有必要綜合應用實驗室各類技術，加強研究，發現更有效、更合適的診斷方法。本研究具體就近些年實驗室有關地中海貧血的各類不同診斷技術的情況進行綜合論述。

地中海貧血；實驗室診斷；技術進展

地中海貧血（thalassemiasl）屬于隱性遺傳性疾病的一種，主要特征是珠蛋白B鏈、α鏈缺失或者合成不足，臨床出現最多的是β地中海貧血以及α地中海貧血[1]。從我國疾病分布情況來看，南方的發病率要高于北方，主要在香港、海南、廣東、廣西等地分布[2]。臨床對于地中海貧血具體類型的診斷必須進行地中海貧血的相關檢測，研究發現，進行血紅蛋白電泳以及開展基因檢測能實現地中海貧血相對準確的診斷，同時可以實現地中海貧血類型的鑒別[3]。對貧血類型進行準確鑒別有助于指導臨床針對貧血的治療，防止臨床濫用鐵劑治療貧血，從而避免地中海貧血患者受到損害。從當前實驗室技術來看，對于地中海貧血的檢測具體包括基因診斷法以及篩查法兩種，下文進行具體的論述。

1 基因診斷

分子診斷是基因診斷的另一種說法，其用于分析檢驗對象某一個轉錄物（mRNA）或者特定基因（DNA），從而診斷遺傳病的一類技術。從我國情況來看，針對地中海貧血的基因診斷在近些年一共經歷了6個發展階段，具體包括DNA點雜交、限制性內切片段長度多態性（RFLP）鏈鎖分析、聚合鏈酶反應（PCR）體外基因擴增、寡核苷酸（ASO）探針雜交、限制性內切酶酶譜分析、芯片技術，尤其是其中的聚合鏈酶反應（PCR）體外基因擴增，當前已經成為實驗室應用最多的一種方法。

1.1 RFLP鏈鎖分析

DNA上面特定的核苷酸序列經DNA限制性內切酶可以完成識別并切割，因此可以得到相應長度的DNA片段，除此之外，堿基突變可能導致酶切位點丟失，也會使得酶切位點形成，這樣會促使酶切片段大小被改變[4]。突變的基因在經相關限制性內切酶水解之后，會改變電泳條帶的大小以及數量，依照這類變化能夠對突變的存在與否進行判斷。但是限制性內切片段長度多態性（RFLP）鏈鎖分析的不足在于無法將受檢者突變基因的類型直接測出，同時這一分析操作起來難度較大。

1.2 寡核苷酸(ASO)探針雜交

通過引物擴增珠蛋白基因的，合成寡核苷酸探針，其和正常以及突變序列完全為互補關系。點上PCR擴增產物于尼龍膜上，將正常、突變ASO探針分別完成雜交并進行標記，假設探針不能實現徹底互補，在特定條件下可徹底洗脫，然后經放射自顯影全面的對雜交結果進行觀察[5]。寡核苷酸（ASO）探針雜交這一方法靈敏、快速，但是也存在不足，有很高的DNA數量以及純度上的要求。當前寡核苷酸（ASO）探針雜交這一方法較多應用于β-地中海貧血基因診斷。

1.3 PCR體外基因擴增

其是一類基因體外擴增技術，DNA聚合酶在PCR的利用下，于體外完成一對引物間的特異DNA片段催化合成。α-地中海貧血的基因診斷中PCR基礎診斷的應用逐漸增多，尤其針對多重PCR，其特點是有4對等位基因的特異引物包含在一個PCR體系內，按照不同突變位點完成特異擴增，然后完成結果判定。多重PCR法檢測右及左缺失、α-珠蛋白基因東南亞缺失。多重PCR可實現對缺失型α-地中海貧血的鑒別，還能夠實現其的基因分型[6]。通過單管多重PCR的應用，能夠將（右及左缺失、α-珠蛋白基因東南亞缺失）迅速、準確的檢測出來，對于α-地中海貧血產前診斷、分子篩查意義突出。

1.4 Southrrn印跡雜交

這重點是用于鑒別DNA靶分子雜交，指的是DNA雜交DNA，在固相支持物上將經電泳分離的等待檢測的DNA片段完成轉印以及結合，繼續選擇DNA標記探針檢測待測的DNA。這一方法可檢測基因缺失狀態，截至當前，這一方法對于α-地中海貧血的診斷依舊是α-地中海貧血基因診斷的標準。

1.5 缺口PCR（Gap-PCR）

缺口PCR的原理是進行2對或者3對引物的設計，也就是在趨勢區域的外側，在與缺失位點臨近的地方進行1對引物的設計，在缺失區域里面進行1對引物的設計。在正常人和雜合子中處于缺失區域中的引物能擴增片段，同時如果是處于缺失純合子，則不能擴增。一對引物處于缺失區域外側，因缺失兩端DNA原本距離很遠，變得靠近，因而可完成擴增特定DNA片段，從而對純合子患者實現準確診斷。研究發現，通過缺口PCR方法的應用，可以將三種缺失型地中海貧血準確檢測出來。缺失序列、設計引物兩側翼序列互補，原本正常情況下處在斷裂點兩側翼相距遙遠的引物由于基因缺失突變變得臨近，因而能實現一定長度片段的擴增；缺失區域有另外一對引物，當處于雜合子情況或完全正常情況下，才能夠完成正常等位基因的擴增。這一方法依據擴增片段大小能實現正常雜合子、純合子個體的準確區分。

1.6 反向點雜交法（PCR-RDB）

和等位基因特異性寡核苷酸探針點雜交原理相比，反向點雜交法的原理存在很大相似性，但是也存在不同，將以往固定靶DNA利用膜上固定探針取代，通過一次雜交能夠檢測未知樣品之間的多種突變，使得傳統雜交法僅僅能夠對一種突變進行檢測這一不足得到改進，反向點雜交法的主要特點包括操作簡便、敏感度高、獲取檢測結果速度快，是近些年國內以及國外使用較多的一種檢測技術。有學者通過反向點雜交法對β-珠蛋白基因有沒有發生17個點的突變進行同時檢測，獲得了滿意的效果[7]。并且反向點雜交法還能夠將突變的具體類型：正常基因、雜合子、純合子、雙重雜合子準確區分出來，對于我國比較多發的β-地中海貧血基因檢測非常適用。且該方法還可診斷非缺失型α-地中海貧血突變。

1.7 熒光PCR

相較于普通PCR，熒光PCR的敏感度要高出超過1000倍，選擇各個顏色的熒光素標記PCR擴增產物，在DNA測序儀上面將各個片段、不同顏色PCR擴增產物實現同時檢測，所以可分辨正常、純合子或者雜合子。經熒光PCR基因掃描，能對一些地區β珠蛋白基因突變進行檢測，熒光PCR的主要特點包括有較高靈敏度、檢測迅速、操作簡便等，并且不需要大量DNA樣本。

1.8 基因芯片

依基因芯片上不同位置可觀察的熒光位點顏色不同以及強弱變化實施地中海貧血基因突變類型的判斷，相較于以往的傳統方法，基因芯片方法基于核酸擴增基礎，通過熒光標記引物延伸，能夠使檢測結果的特異性以及敏感性得到提升。并且因為基因芯片具有高通量這一特點，所以能夠在同一張芯片上完成α、β地中海貧血的基因診斷。這一方法更適用于大面積普查，這一方法的主要特點包括省時、方便。

2 篩查法

2.1 測定血常規

低色素以及小細胞是地中海貧血的最典型特征，MCH＜27 pg、MCV＜80 fl則是血液學中最重要的指標，符合上述標準的可能是缺鐵性貧血或者地中海貧血。將MCH以及MCV作為初篩地中海貧血的方法價值明顯。

2.2 對紅細胞形態學進行檢查

具體有涂片、瑞氏染色，由于貧血程度會有明顯差別，所以相應紅細胞可能會表現為不均勻的大小，存在很多不同異常形態，出現靶形紅細胞或者嗜堿性點彩紅細胞等。越嚴重的貧血，就會出現越明顯的異形性。

2.3 對不穩定血紅蛋白進行測定

（1）熱變性試驗：相較于正常血紅蛋白，不穩定血紅蛋白在溫度升高的時候，發生沉淀的可能性很大。處于50℃-60℃溫度下，α-地中海貧血的沉淀量會偏高[9]。但是這一方法缺乏較高的敏感度，并且受比色影響比較大，但是相較于異丙醇試驗，這一方法的特異性更高。

（2）異丙醇試驗：地貧血液中血紅蛋白存在比較不穩定，在37℃的溫度中且濃度為17%的異丙醇溶液中不穩定血紅蛋白在5分鐘內會發生沉淀，在20分鐘時會有絮狀形成。

2.4 血紅蛋白電泳

實驗室中對于異常血紅蛋白的識別以及檢測最常應用血紅蛋白電泳這一方法，具體包括以下幾種。

（1）珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳：經尿素解離血紅蛋白，組建多肽鏈，不同肽鏈的分離通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的分子篩效應和電荷，獲取各個區帶，假設不同類別珠蛋白鏈合量、結構有異常，珠蛋白鏈就會發生區別正常的變化，經測定不同區帶含量比例，能夠對各珠蛋白基因的表達進行了解，還能夠基本上將β0-β+、α-地中海貧血檢測出來[10]。但是這一方法也存在不足，操作比較復雜，試劑存在比較大的毒性，結果穩定性不滿意，可能導致珠蛋白鏈假陽性。

（2）自動瓊脂糖凝膠電泳：點樣前調整Hb含量為8～12 g/L，稍微稀釋已經制備的Hb液，再加入加樣杯中，經定量儀器添加樣本到加樣孔，設置儀器500 V、20℃，實施電泳處理，時間為25分鐘，完成后取出，置于儀器染色位置，完成對應程序的設定，經儀器自動功能完成各個環節的操作，包括沖洗和染色，脫色以及烘干。結束之后，電泳膠片直接在全自動密度掃描儀上掃描定量各個成分，得出掃描圖譜。經全自動瓊脂糖凝膠對血紅蛋白進行電泳后，顯示其對異常Hb有非常高的分辨力，新生兒Hb Bart，s含量等微量成分能夠清晰顯示1.0%-3.0%的區帶，實現準確的掃描以及定量。

（3）高效液相色譜（HPLC）：當前這一方法多用于HbA2以及HbF的定量分析。有研究證實，通過這一方法的陰陽離子交換層析儀可以實現血紅蛋白的自動化分析，同時完成測定抗堿血紅蛋白，能夠得到穩定結果，且檢測非常簡便迅速。特別針對β-珠蛋白生成障礙性貧血，HPLC能快速實現診斷。

（4）毛細管區帶電泳（CEl）：毛細管區帶全自動電泳法是在石英管（充滿緩沖液）中實施電泳的方法。溶血試劑中置入的紅細胞樣品進行稀釋后在毛細管陽極端進行注射，通過高電壓的作用完成分離，在陰極端415nm的波長下對血紅蛋白各組分含量進行直接檢測。這一方法能夠自動鑒別以及定量HbA2區帶，能夠有效區分聚焦HbA以及HbS間的HbF，同時能夠對其開展精準的測量。

3 結 語

由于科學技術的進步，實驗室當前對于地中海貧血的檢測在技術方面也得到顯著提高，基因診斷以及篩查技術成熟度不斷提高。基因分析用于地中海貧血的診斷可靠性最高，不過這一方法操作比較復雜、需要花費的時間比較長、對操作人員的技術要求也非常高的，所以還無法廣泛推廣。因此臨床必須繼續加強研究，不斷推出更快速方便、更準確，更便于推廣的地中貧血的檢測技術，為臨床診斷和治療地中海貧血提供更科學的指導依據。

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本文編輯：吳玲麗

R556.6

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ISSN.2095-8242.2017.16.3167.02