番茄葉醇提物急性毒性及其抗氧化應激損傷研究

陸宏浩++衛(wèi)智權 閻莉 覃世椿

【摘要】目的：探討番茄葉醇提物的急性毒性及其對脂多糖（LPS）誘導急性炎癥致氧化應激損傷大鼠的保護作用。方法：急性毒性試驗是采用經口途徑給予番茄葉醇提物，測定小鼠的半數(shù)致死量（LD50），并觀察急性中毒表現(xiàn)。50只SD大鼠分為正常組、模型組與番茄葉醇提物654g/kg、327g/kg和218g/kg給藥組，灌胃給藥10 d。腹腔注射LPS復制急性炎癥模型，以酶聯(lián)免疫吸附劑法（ELISA）測定血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHpx）和超敏C反應蛋白（Hs-CRP）水平。結果：番茄葉醇提物單次灌胃給藥的LD50為6539g/kg。番茄葉醇提物可明顯提高急性炎癥大鼠血清SOD、GSHpx水平，并顯著降低Hs-CRP水平。結論：番茄葉醇提物可拮抗LPS引起的急性炎癥的氧化應激損傷。

【關鍵詞】番茄葉醇提物；急性毒性試驗；脂多糖；氧化應激損傷

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）02-0052-02

Acute Toxicity and Protective Effects of Tomato Leaf Alcohol Extract against Oxidative Stress InjuryInduced by Acute Inflammatory

LU Honghao1WEI Zhiquan2YAN Li2*Qin Shichun2

1. Ruikang Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University， Nanning 530012，China；2. Guangxi Traditional Chinese Medical University， Nanning 53000，China

Abstract：In this research， acute toxicity of tomato leaf alcohol extract and protective effects of TLAE against oxidative stress injury induced by acute inflammatory were discussed. The oral lethal dosage （LD50） value of TLAE in mice is65.39g/kg obtained by using single dose acute toxicity testing for pharmaceuticals. Fifty SD rats were randomly divided into control group， model group and three TLAE treated groups of different dose （654，327，218g/kg）.Acute inflammation was induced byintraperitoneal injection oflipopolysaccharide （4mg/kg）.TLAEwere orallygiven once a day for 10 days. The levels of SOD， GSHpx in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.TLAE enhanced the levels of SOD，GSHpxand Lower thelevel of Hs-CRP in serum. These results suggested that the orally given TLAE can markedly restrainthe oxidative stress injury with the LPS-induced acute inflammatory.

Keywords： Alcohol Extract of Tomato Leaves； Acute Toxicity Test； Lipopolysaccharide； Oxidative Stress Injury

番茄葉為茄科多年生草本植物番茄Lycopersicon esculentum Mill的葉，具有特殊氣味。對番茄葉進行的初步化學研究，發(fā)現(xiàn)其可能含有黃酮類、酚類、生物堿、揮發(fā)性成份、皂苷、有機酸等[1-3]。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，番茄莖葉粗提液對細菌具有較強的抑制作用，對霉菌的抑菌作用較弱，且葉粗提液的抑菌濃度高于莖粗提液[4]；番茄葉水提物可顯著抑制LPS 誘導的大鼠急性炎癥及其所致氧化應激[5-6]。番茄葉醇提取物不同極性部位的體外抗氧化試驗表明，不同極性部位均有抗氧化作用[7]。但番茄葉醇提取物的體內抗氧化作用未見報道，因此，研究以LPS誘導急性炎癥大鼠為研究對象，觀察番茄葉醇提物對其血清Hs-CRP、SOD和GSHpx的影響，初步評估番茄葉醇提物的抗急性炎癥氧化應激損傷的作用，并觀察其對小鼠的急性毒性。

1儀器與材料

11實驗動物SPF級昆明小鼠，體質量18～22g，雌雄各半，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK桂2003-0003）。SPF級健康雄性SD大鼠50只，體重220～240g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（實驗動物生產許可證號SCXK（湘）2009-0004）。

12藥品的制備番茄葉采于廣西百色國家農業(yè)科技園區(qū)無公害蔬菜產業(yè)化示范園。取干燥的番茄葉粉碎，加入乙醇浸泡后回流提取，過濾，減壓回收乙醇，濃縮得到流浸膏（相當于原生藥385g/mL），備用。

13試劑大腸桿菌脂多糖（美國Sigma公司，血清型O55：B5）；超敏C反應蛋白（Hs-CRP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHpx）的ELISA試劑盒均為美國R&D公司產品。

14儀器MULTISKANGO酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2方法

21急性經口毒性試驗預試驗結果顯示，番茄葉醇提物的最大致死劑量為110g/kg，最小致死劑量為40g/kg。取小鼠60只，隨機分為6組，給藥劑量按如下方法確定：設定110g/kg為初始劑量，以1∶085為組距得到6個給藥劑量，分別為1100、935、795、676、574、488g/kg。動物禁食不禁水12 h后灌胃給藥，給藥容積40mL/kg。給藥后連續(xù)觀察動物的行為14d，并記錄死亡數(shù)，按改良寇氏法計算出半數(shù)致死量（LD50）。

22番茄葉醇提物對血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平的影響取LD50的1/10，1/20和1/30作為番茄葉醇提取物的高、中、低劑量（654g/kg，TLAE-H；327g/kg，TLAE-M；218g/kg，TLAE-L）。取大鼠50只隨機分為正常組、模型組和番茄葉醇提取物高、中、低劑量給藥組，每組10只。正常組和模型組給蒸餾水，各組動物均灌胃給藥。9d后，腹腔注射LPS（4mg/kg）復制急性炎癥動物模型。禁食不禁水12h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，下腔靜脈穿刺取血，室溫靜置后于40℃離心（4000r/min，5min），分離血清，分裝凍存于-20℃?zhèn)錅y血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平。

采用Hs-CRP、SOD和GSHpx的ELISA檢測試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作。以CurveExpert曲線擬合軟件計算標準曲線的直線回歸方程，分別計算樣品濃度。

23統(tǒng)計學處理所有計量資料均以均數(shù)加減標準差（x[TX-*3]±s）表示，以SPSS 統(tǒng)計軟件進行多個樣本間均數(shù)比較，P<005表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3結果

31急性經口毒性試驗給藥后小鼠出現(xiàn)自由活動減少，精神萎靡，身毛豎起，反應遲鈍，靜臥不動等癥狀，隨著時間的推移，部分小鼠出現(xiàn)呼吸加快，興奮躁動，步態(tài)不穩(wěn)，抽搐等中毒癥狀，并出現(xiàn)死亡。存活小鼠則連續(xù)喂養(yǎng)觀察14d，無動物死亡。結果見表1。按改良寇氏法計算，番茄葉醇提物單次灌胃給藥的LD50為6539g/kg，其 95%可信限為571～749g/kg。

32番茄葉醇提物對血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平的影響腹腔注射LPS后，模型組大鼠血清Hs-CRP水平明顯升高，SOD和GSHpx水平則明顯降低，與正常組比較，其差異均有統(tǒng)計學意義（P<005）。與模型組比較，TLAE的3個給藥組血清GSHpx水平及TLAE-H組、TLAE-M組的水平SOD均明顯升高，Hs-CRP水平顯著降低，其差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。TLAE-L組血清SOD水平雖然高于模型組，但其差異均無統(tǒng)計學意義（P>005）。結果見表2。

4討論

脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細胞壁的重要組成部分，LPS進入人體后，激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，促進大量的內源性細胞因子釋放，激發(fā)機體的炎癥反應，因此其被認為是造成全身性炎癥綜合征的主要原因。前期研究也證明，通過給動物腹膜注射一定劑量的LPS，可成功誘導急性炎癥大鼠模型[5，8]。氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致組織損傷。氧化應激和炎癥緊密相連，抗氧化劑則可以減緩氧化應激帶來的危害。

前期的研究發(fā)現(xiàn)，番茄葉水提物可顯著抑制LPS 誘導的大鼠急性炎癥及其所致氧化應激[5-6]，且番茄葉乙醇提取物不同極性部位在體外均有抗氧化作用[7]。研究結果顯示，番茄葉醇提物可明顯提高急性炎癥小鼠血清SOD、GSHpx水平，并能顯著降低Hs-CRP水平。提示番茄葉醇提物可拮抗LPS引起的急性炎癥的氧化應激損傷。急性毒性試驗結果表明，番茄葉醇提物單次灌胃給藥的LD50為6539g/kg，其 95%可信限為571～749g/kg。

我國是一個農業(yè)大國，每年都將產生大量的農業(yè)廢棄物，這些廢棄物如果能得到有效利用，將成為寶貴的資源，如不經妥善處理進入環(huán)境，將會造成環(huán)境污染和生態(tài)惡化。中國是最主要的番茄及其副產品生產國之一，每年番茄成熟果實采摘后，番茄的莖葉都被廢棄，沒有被進行加工利用。對番茄葉進行抗氧化應激性研究，對如何利用番茄葉，減少其對環(huán)境污染，改善農村生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義，而且在世界能源日益枯竭的情況下，番茄葉作為一種資源，它的綜合利用及其資源化方面的研究也將對農業(yè)與農村可持續(xù)發(fā)展產生重大影響。

參考文獻

[1]潘雪峰， 楊明非， 袁鋒. 番茄莖葉揮發(fā)物的氣相色譜─質譜的定性分析[J].東北林業(yè)大學學報， 2000， 28（6）： 119-120.

[2]孫瑩， 盧志平， 高松紅， 等. 番茄莖葉揮發(fā)性成分的提取與鑒定[J].中國藥物化學雜志， 2001， 11（5）： 277-278.

[3]梁臣艷， 鄧家剛， 馮旭， 等.番茄葉化學成分的初步研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥， 2014， 42（17）： 26-28.

[4][JP3]常慧芳， 彭丹丹， 劉強.番茄莖葉粗提液活性成分抑菌作用的研究[J]. 廣州化工， 2014， 42（17）： 65-66. [JP]

[5]閻莉， 鄧家剛， 衛(wèi)智權. 番茄葉水提物急性毒性及其對急性炎癥的影響[J]. 天然產物研究與開發(fā)， 2013， 25（6）：819-821.

[6]衛(wèi)智權， 鄧家剛， 閻莉. 番茄葉水提物對急性炎癥氧化應激的拮抗作用[J].中國實驗方劑學， 2015， 21（6）：131-134.

[7]杜成智， 王卉， 馮旭， 等. 番茄葉提取物不同極性部位的體外抗氧化作用[J].湖北農業(yè)科學， 2014， 53（4）：884-887.

[8]劉中原， 李延平. 細菌脂多糖的生物活性及作用機制[J].醫(yī)學綜述， 2014， 16（2）：166-169.

（編輯：梁志慶）