CAR-T免疫療法：腫瘤靶向治療的新策略

李孟捷+鄒秋玲+黨尉

摘 要 嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）細胞是一種全新的治療惡性腫瘤的策略，它有別于傳統的手術、放療、化療、抗體藥物治療。CAR-T細胞療法在血液腫瘤的治療中有顯著療效。 本文將綜述CAR-T的結構和抗腫瘤的原理、CAR-T細胞在臨床上的應用以及CAR-T細胞治療所面臨的挑戰及廣闊前景。

關鍵詞 嵌合型抗原受體 免疫治療 腫瘤

中圖分類號：R730.51 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）03-0024-04

Chimeric antigen receptor T cell therapy： a new therapeutic strategy for cancer

LI Mengjie*， ZOU Qiuling， DANG Wei

[Sunshine Guojian Pharmaceutical （Shanghai） Co. Ltd.， Shanghai 201203， China]

ABSTRACT Chimeric antigen receptor T-Cell （CAR-T） is a new approach for the treatment of malignant neoplasms and even advanced malignancies. CAR-T cell therapy is different from traditional operation， radiotherapy， chemotherapy and monoclonal antibody drugs. CAR-T cell therapy has showed a significant effect in the treatment of patients with hematologic malignancies. This article reviews the structure of the principles of antitumor of CAR-T and its application， challenges and broad prospects in clinic.

KEy WORDS chimeric antigen receptor； immunotherapy； tumor

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）是由抗體源性靶向區和T 細胞信號區融合而成。表達CAR后的T細胞可以識別、結合特定的腫瘤細胞表面抗原，分泌細胞因子，殺傷腫瘤細胞。CAR-T細胞治療作為一種全新的治療方式，被2013年《科學》雜志評為全球十大科技創新之首。CAR-T在血液腫瘤的治療中已經取得顯著療效，但是在實體瘤的治療中仍存在很大的困難和挑戰，需要更多的探索和突破。目前國內外已有上百個CAR-T的臨床實驗在開展。本綜述將闡述CAR-T的結構和抗腫瘤的原理、CAR-T細胞在臨床上的應用以及CAR-T細胞治療所面臨的挑戰及廣闊前景。

1 CAR-T的結構和原理

CAR-T細胞即嵌合抗原受體T細胞。CAR的基礎設計中包括一個腫瘤相關抗原結合區（通常來源于抗體抗原結合區域的scFv段）、一個胞外鉸鏈區、一個跨膜區和一個胞內信號區[1]。一旦T細胞表達這種受體，單個融合分子便與抗原進行特異性結合并激活T細胞，因此經嵌合抗原受體修飾的T細胞具有抗體的特異性和效應T細胞的細胞毒作用。CAR一旦與腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA）結合，可通過由CD3或高親和性受體FceRI的胞內區使T細胞活化，表現為CAR依賴的細胞殺傷、增殖及細胞因子釋放[2]。同時CAR-T細胞的擴增倍數可超過1 000倍， 臨床實驗中發現輸入CAR-T細胞六個月后患者體內仍能檢測到高水平表達的CAR[3]。總而言之，CAR-T細胞的靶向性、殺傷活性和持久性均較常規應用的免疫細胞高。

20世紀80年代晚期，以色列科學家Eshhar等[4]開發了第一種CAR-T細胞，即第一代CAR。第一代CAR-T細胞只在T細胞表面表達一個單鏈抗體基因，這個單鏈抗體表達后可以特異性識別腫瘤細胞表面的分子。第一代CAR很快投入臨床試驗，令人遺憾的是，第一代CAR雖然具有特異性的細胞毒性，但沒有表現出顯著的療效。究其原因是因為第一代CAR-T細胞在患者體內持久性差，很快就會耗竭，CAR-T細胞還未接觸到大量的腫瘤細胞就已經凋亡了[5-6]。為了加強CAR激活信號并突破第一代CAR的限制，結合了共刺激結構的第二代CAR相繼被報道，第二代CAR的組成結構中添加了T細胞完全活化和生存必須的第二信號分子（比如CD28或者4-1BB分子）[7-8]。第一個被詳細研究的T細胞共刺激信號受體是CD28，它能夠與靶細胞表面的B7家族成員結合。CD28提供了T細胞激活的第二刺激信號，CD28的共刺激能夠促進T細胞的增殖，IL-2的合成和表達以及抗凋亡蛋白Bcl-xL的分泌。許多研究都表明[9-10]，搭載了“共刺激信號分子”的第二代CAR與第一代CAR相比，抗原特異性不變，T細胞增殖、細胞因子分泌增加，抗細胞凋亡蛋白分泌增加，細胞死亡延遲。之后有研究人員將CD28用CD137（4-1BB）進行替換，使用CD28還是4-1BB，不同的第二代CAR究竟孰優孰劣，不同的研究者用不同的腫瘤在體內和體外的研究中得到的結果不盡相同[5， 11-12]。最近有研究表明4-1BB分子使得CAR-T細胞具有更高的穩定性，減緩了CAR-T細胞在體內的耗竭[13]。總而言之，第二代CAR在隨后的臨床試驗中產生了顯著的療效，從2010年起基于第二代CAR的臨床報道屢次引發震動，特別是對于復發性、難治性的急性淋巴細胞白血病（acute lymphocytic leukemia ，ALL）患者，其完全緩解率高達90%以上。然而在缺乏外源共刺激分子的情況下所有二代CAR均不能產生足夠的IL-2促進T細胞增殖，當給予外源性B7共刺激分子時這些轉基因CAR-T細胞則可產生IL-2促進其增殖[14-15]。隨后，為了進一步增強CAR-T細胞在體內的存活，研究人員開發了第三代CAR，就是在第二代CAR的基礎上再增加一個第二信號分子，比如將CD28和4-1BB分子同時組裝進CAR里面[16]。目前第二代和第三代的設計都各自已有臨床試驗的應用，臨床試驗的數據仍需持續關注[17-19]。最新改良設計的第四代CAR-T表現出了克服免疫抑制微環境的能力，有望成為實體腫瘤治療中的重要手段[20-21]：第四代CAR-T是在第二/第三代CAR-T的基礎上表達一些關鍵的細胞因子，例如IL-12。IL-12被譽為T淋巴細胞的第三信號分子，可見其對T細胞功能的重要性。全身注射IL-12患者會引起嚴重的炎癥副反應，但是通過CAR-T細胞來實現局部表達后，可以在腫瘤病灶處招募NK細胞，或者直接逆轉被耗竭的腫瘤浸潤性T淋巴細胞，從而有效克服腫瘤免疫抑制微環境[22]。

2 CAR-T細胞的臨床應用

CAR-T細胞治療的整個過程如下[5]：首先從患者血液中分離得到的白細胞通過流式或者磁珠分選得到CD4+和CD8+ T細胞，T細胞再使用微球或者人工抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）進行激活和擴增，然后再采用不同的方式（慢病毒、逆轉錄病毒、轉座子和RNA）將改造好的CARs轉入T細胞，經過改造的T細胞進行質量控制后再重新回輸入患者體內以發揮療效。

目前CAR-T細胞治療的臨床實驗主要集中在惡性血液病中。其中研究最多的是CD19這個靶標，CD19特異性表達于惡性和正常B細胞以及B細胞前體細胞，而造血干細胞及非造血細胞則不存在CD19表達[23]。許多臨床數據顯示CART19針對B-ALL的應答率均高于80%[24-26]。盡管進一步的研究仍在繼續，但是CAR-T細胞至少在1例患者體內存在超過10年之久[27]，這也預示著CAR-T細胞可能就是一種“活著的藥物”。同時臨床試驗也發現CD19基因表達下調或者基因突變會導致B-ALL的復發率提高[28-29]。因此其他靶點（CD20，CD22）[19， 30]的臨床試驗也在開展中。同時靶向兩個目標分子的雙靶標CAR-T治療可能會改善這種逃逸。

對于非B細胞性惡性血液腫瘤（例如多發性骨髓瘤）也有一些新的靶點分子應用于CAR-T治療。B細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）在多發性骨髓瘤細胞中高表達，BCMA-CART細胞在異種移植模型中可以殺死人的多發性骨髓瘤細胞[31]，相應的一期臨床試驗正在進行。惡性髓系血液病的治療在過去幾十年均未取得很大的進展，可能CAR-T治療方法將改善這種現狀。基于CD33、CD123靶點的CAR-T治療也已在一期臨床試驗中[32-33]。但是由于CD33、CD123在正常的血液干細胞中也表達，有研究者提出可以將CAR-T治療和骨髓移植手術結合使用[34]。眾所周知CAR-T治療在實體瘤中遇到了很大的挑戰。這主要源于實體瘤在漫長的形成過程中，在腫瘤細胞周圍營造了一個免疫抑制的微環境；另外大部分針對實體瘤的靶點分子在正常組織中也有表達。目前開展的針對實體瘤的CAR-T臨床試驗主要集中在以下幾個靶點：靶向HER-2治療HER-2過表達的實體瘤[35]；靶向GD-2治療成神經細胞瘤和黑色素瘤（NCT01822652和NCT02107963）；靶向EGFRvⅢ以治療成膠質細胞瘤[36-37]。其他的TAA主要還有Mesothelin、PSMA、GPC3、MET、CEA、MUC1和MUC16等[18]，因此CAR-T細胞療法在抗腫瘤方面已開展了廣泛的應用。

CAR-T細胞療法給腫瘤治療帶來了新希望，但是臨床試驗中所產生的不良反應也越來越引起研究者的重視。細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）是CAR-T 細胞治療常見且致死性的并發癥。CRS的發生率和嚴重程度因CAR-T細胞輸入而不同，這與CAR結構、患者的腫瘤負荷及類型等多因素相關[38]。目前仍不清楚是否CRS是達到最好療效所必須的，一般認為部分的CRS毒性是需要的。因此如何平衡CAR-T細胞治療和有效性和安全性需要更多的臨床試驗數據給予更好的解答。CRS經常伴隨著高水平IL-6的分泌，應用IL-6受體拮抗劑（tocilizumab）可明顯改善CAR-T治療后的嚴重CRS問題[39]，因此在CAR-T細胞治療過程中及時恰當控制CRS是非常重要的。B細胞發育不全可以注射丙球蛋白作為補充治療，CAR-T細胞在體內消失后B細胞可以恢復。而對于CRA-T治療后的神經毒性，除癲癇需要接受抗癲癇藥物治療外，其他大部分神經癥狀是可逆的。隨著更多的患者接受CAR-T細胞治療，臨床研究已經重視毒性反應及其處理辦法的研究，包括減少CAR-T細胞的輸入劑量、細胞因子封鎖、類固醇以及補充免疫蛋白的最佳給藥時間和劑量[40]。

3 CAR-T細胞療法的現狀和發展前景

CAR-T細胞治療技術在各種細胞治療策略中表現出了最具前景的發展態勢。但實際上，CAR-T細胞治療也面臨不少挑戰。例如：①CAR-T細胞治療技術實質上是一種靶點依賴型的治療，良好的治療靶點比較少；②某些腫瘤相關抗原在正常細胞有低水平表達，導致CAR-T治療可能會產生脫靶毒性，引發嚴重的副反應；③CAR-T細胞在實體瘤治療中的瓶頸；④部分患者本身T細胞功能低下甚至無法體外擴增；⑤基于病毒表達體系的CAR-T技術的生物安全性值得重視。針對這些問題科學家們也在不斷地探索中。對于CAR-T臨床應用的安全性，目前的主要策略是改用非病毒載體改造CAR-T，及通過自殺基因控制CAR-T細胞的過度擴增及降低嚴重不良反應[41]。非病毒基因轉染方式包括“睡美人（sleeping beauty，SB）”轉座子系統和mRNA轉染[42-43]。在治療實體瘤方面，臨床前的研究顯示第四代CAR-T具有更好的抗腫瘤免疫抑制微環境的能力和腫瘤殺傷能力，有望在血液腫瘤和實體腫瘤中發揮更大作用[22]。還有一些研究發現[44]，在CAR-T細胞中共表達趨化因子CCR2b，也可以增強CAR-T細胞的歸巢能力。應用間皮素特異性mRNA-CAR-T細胞治療間皮素高表達的晚期實體瘤取得了較好的臨床療效，這也為CAR-T細胞針對實體瘤的治療設計提供了新的策略。目前的細胞療法都是個體化的，需要使用患者自體的T細胞進行體外轉化和培養，不利于實現大規模量產。法國Cellectis公司開發通用型CAR-T，即釆用正常第三方細胞來源的T細胞，通過敲除內源性TCR基因以排除同種異體TCR導致的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD），且能進一步提高CAR-T的殺腫瘤效率。這種策略顯著拓寬了CAR-T的細胞來源，使得CAR-T細胞療法更具商業化前景。

4 結語

2012 年一名叫 Emily 的化療不敏感白血病小患者接受了CAR-T治療后，到今年已經第 4年無癌生存。CAR-T 技術為腫瘤治療開啟了新的篇章，眾多的科學家仍在積極探索研究中，多家大型制藥企業也在關注和投資。目前主要競爭者為諾華、朱諾治療公司以及美國凱特公司。CAR-T細胞治療有望在明年獲得上市批準，造福更多的患者。優化 CAR-T的結構，設計出性能高，又安全的 CAR-T 以及CAR-T細胞的大規模生產是當前所面臨的技術難關。今后 CAR-T細胞治療新策略在于：①多靶標的CAR-T，臨床前實驗顯示出更強的抗瘤效應；②CAR-T細胞治療技術仍需與其他治療手段相配合來達到最佳治療效果；③異體CAR-T細胞的開發；④CAR-T治療和免疫檢查點的單克隆抗體（例如PD-1，PD-L1）的聯合使用。隨著技術的不斷改良優化，臨床經驗的積累，多方面資源的整合，我們期待它將會為腫瘤患者們帶來更多的驚喜。

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