溫郁金正丁醇提取物對(duì)胰腺星狀細(xì)胞活化的影響

邱新民 徐毅 葉水鳳 孟立娜

溫郁金正丁醇提取物對(duì)胰腺星狀細(xì)胞活化的影響

邱新民 徐毅 葉水鳳 孟立娜?

目的 觀察溫郁金正丁醇提取物對(duì)體外人胰腺星狀細(xì)胞活化的干預(yù)作用。方法 采用MTT法選取溫郁金正丁醇提取物對(duì)于胰腺星狀細(xì)胞（PSCs）安全且有效的濃度；取胰腺星狀細(xì)胞分空白對(duì)照組、模型組、溫郁金組、溫郁金干預(yù)組，空白對(duì)照組未添加溫郁金及乙醛等，模型組添加乙醛，溫郁金組分低、高濃度溫郁金組，溫郁金干預(yù)組包括低、高濃度溫郁金干預(yù)組，培養(yǎng)后測定PSCs的α-SMA表達(dá)及TGF-β1表達(dá)，記錄結(jié)果，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 （1）一般情況及胰腺星狀細(xì)胞大體狀態(tài)：靜止型胰腺星狀細(xì)胞初代時(shí)形態(tài)偏球形，四代后活化型胰腺星狀細(xì)胞偏梭形，拉絲現(xiàn)象常見。（2）MTT：抑制率＜5%的溫郁金正丁醇提取物終濃度為0.5mg/L、1mg/L。（3）免疫組化法測定α-SMA表達(dá)：溫郁金組細(xì)胞α-SMA陽性表達(dá)率明顯較模型組低（P＜0.05）。（4）ELISA檢測后的TGF-β1的表達(dá)：溫郁金組較模型組的細(xì)胞TGF-β1表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。（5）相關(guān)性分析示：PSCs的TGF-β1與α-SMA表達(dá)間呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 溫郁金正丁醇提取物能有效緩解人類胰腺星狀細(xì)胞的活化。溫郁金正丁醇提取物抑制胰腺星狀細(xì)胞活化的途徑可能與其抑制胰腺組織TGF-β1等表達(dá)水平有關(guān)。

溫郁金 正丁醇 提取物 乙醛 胰腺星狀細(xì)胞

慢性胰腺炎是以胰腺纖維化為特征的胰腺慢性炎性疾病，胰腺星狀細(xì)胞（PSCs）在纖維化進(jìn)程中起重要作用，在各種理化因素作用下，PSCs發(fā)生活化，表達(dá)α-SMA，膠原蛋白增加，最終導(dǎo)致胰腺纖維化。目前在慢性胰腺炎研究過程中發(fā)現(xiàn)，溫郁金有減輕胰腺纖維化的作用，現(xiàn)代藥理及臨床研究均表明溫郁金具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理活性［1-2］。作者前期研究［3］發(fā)現(xiàn)，溫郁金正丁醇提取物可干預(yù)大鼠CP胰腺纖維化，其機(jī)制可能與溫郁金中的姜黃素通過抑制PSCs激活有關(guān)。本文探討溫郁金提取物對(duì)體外人PSCs活化的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥材、試劑 胰腺星狀細(xì)胞購于武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司（PriCells），置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫郁金藥材購自浙江省中醫(yī)院中藥房，DMSO購自德州卓越化工有限公司，正丁醇購自杭州大方化學(xué)試劑廠，TGF-β1ELISA試劑盒購自武漢博士德公司，大鼠抗人α-SMA單克隆抗體購自武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取PSCs分以下各組：空白對(duì)照組、溫郁金組、溫郁金溶劑對(duì)照組、模型組、溫郁金干預(yù)組，空白對(duì)照組未添加溫郁金及乙醛、DMSO的正常PSCs組；溫郁金組為添加溫郁金正丁醇提取物的PSCs組；溫郁金組分為低濃度溫郁金組及高濃度溫郁金組：低濃度溫郁金組為0.5mg/L，高濃度溫郁金組為1mg/L，因溫郁金正丁醇提取物難溶于水，故選DMSO在本實(shí)驗(yàn)中為PSCs的溶劑，溫郁金溶劑對(duì)照組為添加DMSO的PSCs組，DMSO含量為0.8%，模型組為添加100mmol/L乙醛的PSCs組，溫郁金干預(yù)組分低、高濃度溫郁金干預(yù)組，低濃度溫郁金干預(yù)組為100mmol/L乙醛+0.5mg/L溫郁金正丁醇提取物的PSCs組，高濃度溫郁金干預(yù)組為100mmol/L乙醛+1mg/L溫郁金正丁醇提取物的PSCs組。MTT法時(shí)藥物濃度分別為：0.5mg/ L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L，以MTT法測定溫郁金正丁醇提取物對(duì)于PSCs的安全有效濃度，本實(shí)驗(yàn)以此法來選定溫郁金藥物對(duì)PSCs抑制率＜5%的濃度，并以免疫組化法檢測PSCs的α-SMA水平，取PSCs上清液檢測TGF-β1時(shí)采用ELISA法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（x±s）表示，如方差齊性，多組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較用最小極差法（LSD-t法）；如方差不齊，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。兩變量間相關(guān)性檢驗(yàn)采用直線相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)于PSCs抑制率＜5%的溫郁金正丁醇提取物濃度是0.5mg/L、1mg/L，兩種劑量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），之后的溫郁金組溫郁金正丁醇提取物濃度皆取用0.5mg/L及1mg/L。

2.2 PSCs的α-SMA表達(dá) 細(xì)胞置于十二孔板24h后，均已貼壁，此時(shí)添加各種劑量試劑，24h后各種試劑充分作用于細(xì)胞后，行免疫組化檢查，以二級(jí)計(jì)分法統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞陽性率，結(jié)果顯示：模型組6例陽性，干預(yù)組4例陽性，溫郁金組1例陽性，見表1。

表1 模型組、干預(yù)組、溫郁金組α-SMA灰度值［n=6，（x±s）］

2.3 PSCs上清液TGF-β1表達(dá) 見表2。

表2 各組PSCs24h后的TGF-β1檢驗(yàn)結(jié)果［n=6，（x±s）］

3 討論

PSCs在胰腺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，在各種刺激作用，如細(xì)胞因子TGF-β1等作用下，PSCs發(fā)生活化、表達(dá)α-SMA等蛋白，其本質(zhì)是以膠原為主的ECM合成增加，降解相對(duì)減少，即兩者失去動(dòng)態(tài)平衡，致使過多ECM 沉積，從而使膠原纖維增多，最終導(dǎo)致胰腺纖維化發(fā)生［4］。

Masamune等［5］發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制PSCs的激活，溫郁金正丁醇提取物主要成分是姜黃素。馬曉華等［6］研究證實(shí)，姜黃素具有抗誘變、抗腫瘤等作用。本資料顯示，濃度在0.5mg/L、1mg/L的溫郁金正丁醇提取物對(duì)于PSCs的抑制率最低，抑制率＜5%。溫郁金正丁醇提取物濃度取抑制率＜5%的區(qū)間，與乙醛比較觀察藥物對(duì)細(xì)胞的活化的影響，經(jīng)細(xì)胞鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)溫郁金正丁醇提取物對(duì)于細(xì)胞的活化有抑制作用，對(duì)經(jīng)乙醛誘發(fā)的PSCs活化也有抑制作用。α-SMA的表達(dá)是PSCs活化的標(biāo)志之一，靜止型PSCs不表達(dá)α-SMA，在胰腺發(fā)生病變或損傷時(shí)，PSCs在各種活化因子作用下失去維生素A脂滴，活化并大量表達(dá)α-SMA，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)免疫組化證明，乙醛組α-SMA表達(dá)呈100%陽性，溫郁金+乙醛組有66.7%陽性，溫郁金組16.7%陽性，提示加入溫郁金正丁醇提取物后，細(xì)胞表達(dá)α-SMA減少。

PSCs的活化與多種細(xì)胞因子相關(guān)，如TGF-β1，TGF-β1被認(rèn)為是較為明確的促胰腺纖維化生長因子，可激活PSCs，刺激其合成包括I型膠原在內(nèi)的多種ECM，促進(jìn)胰腺纖維化發(fā)生［7］，PSCs活化后可自行分泌TGF-β1。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)ELISA檢測，溫郁金組細(xì)胞TGF-β1含量較乙醛組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，溫郁金+乙醛組細(xì)胞TGF-β1含量與溫郁金組、乙醛組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

相關(guān)性分析顯示PSCs的TGF-β1與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)（r值分別為0.854，P均＜0.01），提示隨著PSCs的TGF-β1表達(dá)減少，其α-SMA的表達(dá)也隨之減少。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部).北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2005, 194-194.

［2］ 肖培根.新編中藥雜志.北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2002.

［3］ 邱新民, 章復(fù)龍, 徐毅.溫郁金提取物對(duì)胰腺纖維化模型大鼠血清羥脯氨酸的影響.浙江臨床醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 14(2)：132-134.

［4］ 孫軫,郝建宇,龐寶珍等.吸煙與飲酒致胰腺損傷的實(shí)驗(yàn)研究.中華消化雜志, 2010, 30(8)：539-543.

［5］ Masamune A, Satoh M, Kikuta K, et al. Inhibition of p38 mitogenactivated protein kinase blocks activation of rat pancreatic stellate cells. Pharmacol Exp Ther, 2003, 304：8-14.

［6］ 馬曉華, 梁海曼, 沃興德.姜黃素抗腫瘤作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究概況.國外醫(yī)學(xué)腫瘤分冊(cè), 1999, 26(1)：21-23.

［7］ Yoo BM, Yeo M, Oh TY, et al.Amelioration of pancreatic fibrosis in mice with defective TGF-beta signaling. Pancreas, 2005, 30：e71-79.

Objective To observe the intervention effect of the Curcuma wenyujin N-butanol Extract to human pancreatic stellate cells activation in vitro，and to explore its possible mechanism. Methods MTT method was used to select for pancreatic stellate cells（PSCs）safe and effective concentration，Divided pancreatic stellate cells into blank control group，model group，curcuma wenyujin group，the intervention group，blank control group without addition of Curcuma and acetaldehyde in the PSCs group，model group to add100mmol/L B PSCs of aldehyde group of Curcuma components，low，high concentrations of Curcuma wenyujin group，respectively，add 0.5mg/L 1mg/L wenyujin Nintaus butanol extract of Curcuma wenyujin PSCs group，intervention group consists of low，high concentrations of Curcuma wenyujin intervention group，low concentrations of the intervention group to add100mmol/L acetaldehyde +0.5mg/L Wen Yu Nintaus butanol extract of PSCs group，high concentration of Curcuma wenyujin intervention group to add100mmol/L acetaldehyde +1mg/L Wen Yu Nintaus butanol extract of group PSCs. Continue to develop after 24h immunohistochemical determination of PSCs α -SMA expression and ELISA method for the determination of PSCs supernatants of TGF-β1 expression，recording of results，and the correlation analysis. Results （1）The general situation and the general state of PSC：the morphology of first generation PSC was similar to the spherical，but the morphology after four generations was similar to the spindle，and drawing phenomenon was common；（2）MTT：The inhibition rate of＜5% were the concentration of 5 mg/L，10mg/L，and 20mg/L of Curcuma wenyujin N-butanol Extract；（3）α-SMA expression： the α-SMA expression of cells added with ethanol，acetaldehyde were positive，cells added with Curcuma wenyujin N-butanol Extract were negative；（4）Content of TGF-β1：TGF-β1 content of the cells added ethanol、acetaldehyde were significantly higher than the cells added t Curcuma wenyujin N-butanol Extract；（5）The correlation analysis indicated： PSCs TGF-β 1 andα -SMA expression positively correlated between（R values were respectively 0.854，P＜0.01），there were significant differences in statistical analysis. Conclusion Curcuma wenyujin N-butanol extract can effectively reduce the activation of human pancreatic stellate cell（PSC），its mechanism may be related to the inhibition of the expression of the TGF-β1 of pancreatic tissue.

Curcuma wenyujin N-butanol Extract Pancreatic Stellate Cells（PSCs）

310000 杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院（邱新民 葉水鳳）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（孟立娜 徐毅）

*通信作者