二甲雙胍對人肺腺癌A549細胞增殖影響及其機制

劉 單，蘭光友，鄧述愷

(1.西南醫科大學附屬醫院呼吸內一科，四川 瀘州 646000；2.自貢市第一人民醫院呼吸內科，四川 自貢 643000)

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，隨著抗腫瘤藥物不斷更新，找到療效較好、安全性高、不良反應輕的抗腫瘤藥物，將為肺癌患者提供新的希望。二甲雙胍過去主要用于2型糖尿病的降糖治療。近年來，相關基礎研究[1]表明：二甲雙胍可能通過LKB1-AMPK-mTOR通路、降低宿主胰島素水平、誘導細胞周期停滯、抑制腫瘤新生血管的生成和炎癥反應、抑制氧自由基的生成、抑制腫瘤干細胞等抑制腫瘤細胞生長，也可通過增強放化療的敏感性、誘導自噬、激活免疫系統、抑制UPR等途徑發揮抗腫瘤作用。本實驗將初步探討二甲雙胍抗肺癌的可能機制，為今后的實驗及臨床提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 人肺腺癌A549細胞(西南醫科大學附屬醫院中心實驗室)；二甲雙胍原藥粉劑(美國Sigma公司)；RPMI-1640培養基、MTT試劑盒、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；HyClone胎牛血清(上海拜力生物工程有限公司)；CO2恒溫孵育箱(美國Napco公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 A549細胞培養 將A549細胞加于體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，于37 ℃、體積分數5% CO2恒溫孵育箱中生長，貼壁85%時按13傳代，選取2～4代用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測不同濃度、不同時間下二甲雙胍作用A549細胞的增殖抑制率 將A549細胞接種96孔板，按每孔4×104·mL-1計數，待細胞生長貼壁后，按100 μL二甲雙胍且濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol·L-1分別作用A549細胞(5個實驗組)，每個濃度設置6個復孔，同時設置對照組(加無血清培養基100 μL)，分別作用24、48、72 h后每組各孔加入10 μL MTT溶液培養4 h，棄上清，每組各孔加入100 μL Formanzan溶解液，再培養4 h，在檢測儀490 nm處測定各孔吸光度(OD)值，記錄結果，根據公式計算出細胞生長抑制率。計算公式：抑制率=[1-(實驗組OD值 /對照組OD值)] ×100%。上述實驗重復3次。

1.2.3 ELISA檢測COX-2及VEGF蛋白的表達 采用100 μL二甲雙胍且濃度依次為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol·L-1(實驗組)，干預已貼壁生長的A549細胞，每個濃度設置6個復孔，同時設置標準品組(標準品)、空白孔(蒸餾水)；干預72 h(最佳抑制時間)后，收集細胞，濃度約為106·mL-1。分別按照說明加樣，各孔加入50 μL酶標試劑，再孵育、洗滌、顯色，最后終止。采用酶標儀在450 nm波長測定每個孔的OD值。測量OD值：波長調至450 nm，以空白孔凋零，測每孔的吸光度OD值，試驗重復3次。

2 結果

2.1 二甲雙胍對A549細胞生長抑制的影響 不同濃度二甲雙胍(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol·L-1)作用A549細胞24、48及72 h后，OD值隨濃度的增加而降低，而細胞生長抑制率隨濃度增加而增加，但24 h差異無統計學意義(P>0.05)；48 h及72 h差異有統計學意義(P<0.05)，各組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)，72 h抑制率更強。見表1。

2.2 各組細胞上清液中COX-2、VEGF水平的比較 二甲雙胍干預A549細胞72 h后，各實驗組(濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol·L-1)均可見A549細胞上清液中COX-2、VEGF的水平下降，各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組OD值及抑制率的比較

注：48、72 h時各組兩兩比較，P均<0.05；5個實驗組中同一組不同時間點比較，P均<0.05

表2 各組細胞上清液中COX-2、VEGF水平的比較 ng·mL-1

注：各組兩兩比較，P均<0.05

3 討論

二甲雙胍主要用于2型糖尿病的治療，其機制一方面通過抑制肝臟糖異生、提高外周組織對胰島素的敏感性及增加對葡萄糖的攝取和利用而降低血糖；另一方面因其不增加體重、改善血脂譜、降低小細胞聚集、增加纖溶活性等功效用于延緩和改善糖尿病血管并發癥。近年來，作為“老藥新用”的典范，越來越多研究顯示，二甲雙胍能抑制2型糖尿病患者患食管癌[2]、胃癌[3]、肝癌[4]、胰腺癌[5]、乳腺癌[6]等多種惡性腫瘤的風險。相關基礎研究[7-8]表明二甲雙胍能通過激活AMPK途徑、誘導細胞周期停滯、降低胰島素及胰島素樣生長因子-1、增加放化療及靶向治療效果等途徑發揮抗腫瘤作用。

本實驗采用MTT檢測不同濃度二甲雙胍分別作用A549細胞24 h、48 h、72 h后的增殖抑制率，發現：除24 h外，二甲雙胍對A549細胞具有增殖抑制作用，且抑制作用與作用濃度及時間有關聯，這一結論也與Guo等[9]的研究結果相吻合。本實驗中24 h各組增值抑制率差異不具有統計學意義，其可能原因與二甲雙胍干預時間過短或選擇濃度過低有關。

COX-2又稱誘導型環氧化酶，在大多細胞中不表達或少量表達，傳統研究主要集中在炎癥反應方面，當人體受到外傷或感染等刺激后產生，從而促進白三烯、羥基環氧素等炎性介質及大量炎癥細胞、炎癥因子共同參與炎性反應。現代醫學認為慢性炎癥與許多包括肺癌在內的腫瘤的發生發展密切相關，這是腫瘤的又一大特征[10]。COX-2在腫瘤發生、增長及轉移過程中起著重要的作用，研究顯示COX-2能夠降低凋亡相關基因BCL-2的表達，以促進其磷酸化，抑制肺癌細胞凋亡，且可促進survivin蛋白泛素化，促進肺癌細胞產生凋亡耐受[11]。此外，COX-2還能促進腫瘤新生血管的形成[12]。相關研究表明，COX-2高表達的腫瘤細胞能夠增強腫瘤細胞血管的生存能力、轉移能力以及促進血管內皮細胞的遷移[13]。

VEGF是血管內皮細胞特異性肝素結合生長因子，可在體內誘導血管新生，是目前已知的最強的促血管形成因子之一，腫瘤的生長、浸潤和轉移離不開新生毛細血管的形成，VEGF能夠作用于血管內皮細胞，促進細胞分裂和毛細血管出芽生長，為腫瘤的增殖和轉移提供相對有利的微環境[14]。徐建平等[15]發現，VEGF參與了非小細胞肺癌的發生發展，病理分期越晚，分化越低，其陽性率越高，其可作為非小細胞肺癌預后的標志物。那么VEGF和COX-2在某些信號通路方面可能存在聯系，發揮相互協同作用，從而促進腫瘤的發生發展。

在我們的實驗中，選取二甲雙胍對A549細胞抑制作用最強的時間點72 h為時間點，并通過ELISA法檢測A549細胞上清液中COX-2及VEGF的表達水平，結果顯示各實驗組COX-2及VEGF的蛋白表達水平隨細胞增殖抑制率的下降而降低。總之，二甲雙胍可能通過下調COX-2及VEGF的表達發揮抑制A549細胞生長的作用。

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