人肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合肽的篩選與驗(yàn)證

樊敏杰，金 瑾，韓化敏

(拜西歐斯(北京)生物技術(shù)有限公司，北京 100070)

肺癌發(fā)生于支氣管黏膜上皮，發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，近50 a來(lái)肺癌的發(fā)病率顯著增高，在歐美工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)的一些工業(yè)大城市中，肺癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中已居首位，在女性中發(fā)病率也迅速增高，是對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1-2]。由于發(fā)病隱匿，早期多無(wú)癥狀，幾乎2/3的肺癌患者在就診時(shí)已是晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，我國(guó)肺癌早期診斷率較低，患者5 a生存率僅有10%，國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家是15%～20%[3-4]，這個(gè)差距就是早期診斷問(wèn)題。臨床上傳統(tǒng)的診斷方法如胸片、支氣管鏡、痰細(xì)胞學(xué)檢查等方法，缺乏足夠的特異性和敏感性，因此市場(chǎng)上急需開(kāi)發(fā)出一種用于臨床診斷方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 隨機(jī)十二肽噬菌體展示試劑盒購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司，包括隨機(jī)十二肽噬菌體展示文庫(kù)(1.5×1013pfu·mL-1)、E.coli ER2738 宿主菌、-96 gⅢ測(cè)序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’；人支氣管上皮細(xì)胞16HBE購(gòu)自廣州吉妮歐生物技術(shù)有限公司；人肺癌細(xì)胞A549由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所贈(zèng)送；M13單克隆抗體購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司。

LB培養(yǎng)基：每L含：10 g細(xì)菌用胰蛋白胨(英國(guó)Oxoid公司，批號(hào)LP0042)，5 g酵母提取物(英國(guó)Oxoid公司，批號(hào)LP0021)，5 g NaCl(上海索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)S8211)。高壓滅菌，室溫貯存。

LB/IPTG/Xgal平板：將0.25 g異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG，上海索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)I8070)溶于5 mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)溶液中。溶液于-20 ℃避光貯存。向LB培養(yǎng)基中加入瓊脂粉(15 g·L-1)，高壓滅菌，冷卻至低于70 ℃時(shí)，加入1 mL IPTG/Xgal，混勻后平鋪在無(wú)菌的細(xì)菌用培養(yǎng)平板中。瓊脂凝固后將平板于4 ℃避光貯存。

頂層瓊脂：每L含：10 g細(xì)菌用胰蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g NaCl，1 g MgCl2·6H2O，7 g瓊脂粉。高壓滅菌，分成50 mL等份。將凝固后的固體培養(yǎng)基貯存于室溫，用時(shí)微波爐融化。

四環(huán)素(Tet)(上海索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)T8180)貯液：以20 mg·mL-1的濃度溶于乙醇中。-20 ℃避光貯存。用前搖勻。

LB-Tet培養(yǎng)基：1 L LB培養(yǎng)基加入1 mL Tet貯液。

LB-Tet平板：向LB培養(yǎng)基中加入瓊脂粉(15 g·L-1)，高壓滅菌，冷卻至低于60 ℃時(shí)，加入1 mL Tet貯液，混勻后平鋪在無(wú)菌的細(xì)菌用培養(yǎng)平板中。凝固后將平板于4 ℃避光貯存。如果平板顯棕色或黑色則不宜使用。

封閉緩沖液：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%將脫脂奶粉(美國(guó)BD公司，批號(hào)232100)溶于磷酸鹽緩沖液中。過(guò)濾除菌，4 ℃貯存。

PEG/NaCl：含2.5 mol·L-1NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%聚乙二醇(PEG)-8000(上海索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)p8260)。高壓滅菌，室溫貯存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 購(gòu)買(mǎi)復(fù)蘇細(xì)胞接收到貨后，更換新的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%高糖DMEN培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞融合達(dá)80%以上質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶進(jìn)行傳代，培養(yǎng)3代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。A549細(xì)胞同16HBE培養(yǎng)方式一致，培養(yǎng)3代以上可使用。

1.2.2 隨機(jī)十二肽噬菌體篩選 取一個(gè)培養(yǎng)于T175瓶生長(zhǎng)達(dá)90%飽和的16HBE細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.25% 的EDTA消化，計(jì)數(shù)取1×107個(gè)300 g離心5 min，棄上清，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液重懸封閉細(xì)胞，4 ℃ 2 h。取10 μL原始噬菌體肽庫(kù)即1.5×1012的噬菌體稀釋到1.5 mL封閉液內(nèi)，37 ℃ 2 h。封閉過(guò)的噬菌體與16HBE細(xì)胞混合，孵育吸附2小時(shí)。孵育期間取1個(gè)培養(yǎng)于T175瓶生長(zhǎng)達(dá)90%飽和的A549細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的EDTA消化，計(jì)數(shù)取1×107個(gè)細(xì)胞300 g離心5 min，1.5 mL封閉液重懸，封閉2 h。將孵育完畢的16HBE細(xì)胞，400 g離心5 min，小心吸出上清加入封閉過(guò)的A549細(xì)胞，孵育2 h。將A549細(xì)胞300 g離心5 min，棄掉上清，加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，重復(fù)洗滌10次，將細(xì)胞重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液中。取10 μL測(cè)定滴度，剩余噬菌體感染E.coli ER2738宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增，用于下一輪篩選。重復(fù)以上操作進(jìn)行第2、3、4輪篩選。除第1輪投放噬菌體原始文庫(kù)，第2、3、4輪分別采用上一輪洗脫液擴(kuò)增噬菌體，其余條件均與第1輪一致。每輪篩選前后均使用LB/IPTG/Xgal瓊脂平板測(cè)定噬菌體滴度。并計(jì)算回收率。經(jīng)4輪淘篩過(guò)后，將獲得的特異性噬菌體肽庫(kù)，培養(yǎng)于LB/IPTG/Xgal瓊脂平板上，挑分離良好的藍(lán)色噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增。短期4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 陽(yáng)性克隆ELISA初步鑒定 將A549細(xì)胞以5×104/孔的密度，接種于96孔板，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛37 ℃固定30 min；加200 μL/孔封閉液37 ℃ 1 h；磷酸鹽洗滌3遍，加噬菌體樣品孵育2 h；磷酸鹽洗滌3遍，加50 μL/孔2 000倍稀釋的M13抗體，37 ℃孵育1 h；洗滌4遍后加100 μL TMB顯色；加50 μL孔2 mol·L-1H2SO4終止，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。以M13K07作為陰性對(duì)照，P/N>3為陽(yáng)性。共篩選394個(gè)克隆，初步挑選讀數(shù)較高的10個(gè)克隆進(jìn)行下一步驗(yàn)證，分別為140、141、179、193、217、278、290、295、362、385。

1.2.4 細(xì)胞ELISA檢測(cè)陽(yáng)性克隆靶向性 細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量滿(mǎn)足時(shí)，分別將16HBE細(xì)胞、A549細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的EDTA消化，計(jì)數(shù)取每份5×106個(gè)于2 mL離心管內(nèi)，各取9份，300 g離心5 min，1 mL封閉緩沖液重懸于2 mL離心管內(nèi)，4 ℃搖動(dòng)封閉1 h。同時(shí)，將以上得到的每個(gè)噬菌體克隆取0.5 mL于2 mL離心管，再分別加入0.5 mL封閉緩沖液，孵育1 h。另取M13K07輔助對(duì)照噬菌體同樣方法做封閉處理。將封閉結(jié)束的細(xì)胞與封閉結(jié)束后的噬菌體混合到15 mL離心管內(nèi)，4 ℃搖動(dòng)孵育2 h。將細(xì)胞300 g離心5 min，小心吸除上清液，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液吹洗均勻，再300 g離心5 min。如此反復(fù)洗滌細(xì)胞5次。將經(jīng)封閉緩沖液2 500倍稀釋的M13抗體分別取0.5 mL加到各份細(xì)胞內(nèi)重懸，4 ℃搖動(dòng)孵育1 h。再洗滌5遍。用100 μL TMB顯色，加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm處讀數(shù)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，顯示278號(hào)克隆均呈現(xiàn)高親和力。

1.2.5 噬箘體克隆測(cè)序分析 將噬箘體擴(kuò)增上清液，用-96 gⅢ測(cè)序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’送北京金唯智生物科技有限公司全自動(dòng)測(cè)序并分析。

2 結(jié)果

2.1 隨機(jī)十二肽噬菌體篩選與分析結(jié)果 以16HBE細(xì)胞為非特異性吸附，A549細(xì)胞為靶細(xì)胞，完成4輪的淘篩，通過(guò)滴度測(cè)定對(duì)每輪的投入量與回收量進(jìn)行分析，呈現(xiàn)逐漸遞增的富集效果。見(jiàn)表1。

表1 差減吸附篩選噬箘體富集效應(yīng)

2.2 陽(yáng)性克隆ELISA初步鑒定 通過(guò)ELISA對(duì)第4輪淘篩后394個(gè)噬箘體克隆進(jìn)行初步鑒定，并分析其與肺癌細(xì)胞結(jié)合情況，以M13K07噬箘體為陰性對(duì)照排除非特異性結(jié)合。以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD450 nm比值≥3為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選出最高的10組克隆，分別為140、141、179、193、217、278、290、295、362、385。見(jiàn)圖1。

圖1 與A549細(xì)胞高親和力噬箘體克隆

2.3 細(xì)胞ELISA檢測(cè)陽(yáng)性克隆靶向性 選以上10個(gè)陽(yáng)性克隆，分別與16HBE細(xì)胞、A549細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水平ELISA，鑒定其靶向性，結(jié)果顯示，278號(hào)淘篩噬箘體克隆顯示出與A549細(xì)胞高的靶向性。此克隆與A549高親和力，而與16HBE幾乎沒(méi)有結(jié)合。見(jiàn)圖2。

圖2 噬箘體克隆靶向性結(jié)合情況

2.4 DNA測(cè)序及同源性分析結(jié)果 將278號(hào)克隆(同時(shí)將179、193、290、295測(cè)序，分析同源性需要)送至北京金唯智生物科技有限公司用試劑盒自帶96 gⅢ測(cè)序引物測(cè)序，推導(dǎo)出278號(hào)噬菌體克隆DNA序列為AGTGATTGGAAGCTTTATACGCAGCCTATTACTCTG，其所編碼的12個(gè)氨基酸的多肽的氨基酸序?yàn)镾DWKLYTQPITL，同時(shí)另外4個(gè)克隆除295外，均為SDWKLYTQPITL。說(shuō)明此序列存在高重復(fù)率。經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)肺癌相關(guān)已知序列，很可能為新發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)序列。

3 討論

噬菌體展示技術(shù)建立于1985年,該技術(shù)通過(guò)基因工程改造，將外源基因與絲狀噬箘體融合，獲得的重組噬菌體能被特定抗體所識(shí)別。而后在多領(lǐng)域得到了發(fā)展:新型疫苗研制方面的應(yīng)用、酶抑制劑篩選中的應(yīng)用、醫(yī)學(xué)診斷和治療方面的應(yīng)用。近年來(lái)主逐漸成為腫瘤靶向治療的研究方向之一[5-7]，在體外已成功淘篩到針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞等特異性結(jié)合肽，可能在腫瘤的診斷、靶向治療等方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[8-9]。腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生或分泌并釋放到血液、細(xì)胞、體液中，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類(lèi)物質(zhì)。其具有高效、高靈敏、方便、標(biāo)本易獲取及創(chuàng)傷輕等優(yōu)點(diǎn)，因此檢測(cè)、篩選及鑒定腫瘤標(biāo)志物一直是肺癌早期診斷研究的重點(diǎn)。

本研究利用A549細(xì)胞為靶細(xì)胞，16HBE細(xì)胞為吸附細(xì)胞，經(jīng)過(guò)4輪淘篩，共挑選了394個(gè)克隆初步進(jìn)行非特異性排除，優(yōu)選了10個(gè)高親和力克隆進(jìn)行后續(xù)的靶向性鑒定，結(jié)果得到1個(gè)克隆與A549細(xì)胞高親和力，而與正常16HBE細(xì)胞不結(jié)合。測(cè)序后得到其序列，數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST未有肺癌已知相關(guān)序列，但與芽孢桿菌屬硫酸酯酶存在同源性，查閱文獻(xiàn)又發(fā)現(xiàn)Proteobacteria門(mén)細(xì)菌與人高度同源[10]， 其配體硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，在腫瘤生物學(xué)作用的酶是C6-內(nèi)脫磺基酶(endo-6-O-sulfotase,Sulf),其功能是選擇性去除葡萄糖酰胺六號(hào)碳上的磺基。Sulf在哺乳細(xì)胞內(nèi)有2個(gè)異構(gòu)體,即Sulf1和Sulf2。與肝素酶類(lèi)似,修飾酶在多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)增高,可能通過(guò)調(diào)節(jié)某些生長(zhǎng)因子的活性，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步惡化[11]。但肺癌細(xì)胞并未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道，結(jié)合機(jī)制需要做近一步研究。但已說(shuō)明噬箘體展示技術(shù)在尋找腫瘤特異性識(shí)別多肽的領(lǐng)域具有重要價(jià)值，為臨床診治提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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