酶膜耦合法制備均一分子量膠原蛋白多肽

李 蕓，邵 炎，周 婉，劉 璐，唐松山，劉 濤1,*

(1.廣東藥科大學藥用生物活性物質研究所 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室， 廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學藥學院， 廣東 廣州 510006；4.廣東藥科大學基礎學院，廣東 廣州 510006)

酶膜耦合法制備均一分子量膠原蛋白多肽

李 蕓1,2，邵 炎1,2，周 婉1,3，劉 璐1,3，唐松山4，劉 濤1,4*

(1.廣東藥科大學藥用生物活性物質研究所 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室， 廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學藥學院， 廣東 廣州 510006；4.廣東藥科大學基礎學院，廣東 廣州 510006)

為得到均一分子量膠原蛋白多肽，首先用固定化胰蛋白酶對膠原蛋白進行柱上循環酶切，經過3次柱上循環酶切后目標肽收率達到最高，含量較初始膠原蛋白提高70%以上；然后采用超濾法對酶解液進行分離，膠原蛋白多肽數均分子量達到15 600 Da，具有良好的分子分布形態(M10=8 300 Da，M90=21 000 Da)，目標肽總收率為23%，相對收率為174%。將制備的均一分子量膠原蛋白多肽用于交聯型血漿代用品的制備，產品具有理想的體內應用理化指標。通過優化膜分離組件與酶解循環條件，可制備適用于不同原料來源和不同應用需求的均一分子量膠原蛋白多肽。

膠原蛋白多肽；固定化酶；超濾；均一分子量

膠原蛋白是動物體內含量最多、分布最廣的一類功能性高分子蛋白質家族。膠原蛋白具有良好的生物相容性和低免疫原性，從膠原蛋白水解產物中篩選具有潛在生物活性和藥用價值的膠原蛋白多肽組分或單體已成為持續研究熱點[1-2]，此外，膠原蛋白除在食品、化妝品、血漿代用品和藥用輔料等傳統領域得到廣泛應用外，在組織工程、藥物輸送和仿生材料等領域的應用也取得了一系列令人矚目的成績[3-6]。如殼聚糖-交聯蛋白交聯膜作為角膜材料，表現出了良好的光學透明性和機械強度[7]；包含目標藥物的戊二醛交聯膠原蛋白海綿，具有低吸水性、更持久有效的藥物釋放性、抗菌活性和更低的酶解活性[8]；通過改變醋酸纖維素與明膠的比例制成的靜電紡絲在透氣性、吸收性和粘附性等方面具有優勢，用作皮膚支架時，可有效粘附于傷口，并在皮膚再生階段支持細胞增殖，用作傷口輔料時，易于去除且不會造成組織損害[9]。

從多分散膠原蛋白多肽混合物中高效可控地制備均一分子量膠原蛋白多肽組分，從而使膠原蛋白多肽在體內應用時獲得更有效、可控的半衰期和更平穩的降解吸附特點，是膠原蛋白多肽應用于各種生物醫學工程基礎材料的工藝研究重點之一[10-11]。酶法是將大分子膠原蛋白降解為小分子膠原蛋白多肽的常用方法，在保持膠原蛋白原始結構和生物活性等方面具有突出優勢。相比游離酶法，固定化酶法利于反應控制和連續化大規模生產，可實現酶與多分散膠原蛋白多肽的即時分離。酶降解膠原蛋白多肽產物可通過鹽析、有機溶劑沉淀、超速離心、層析和超濾等方法獲得進一步的分級，其中基于分子大小的超濾法具有定向分離精度高、處理通量大及可連續化分離等突出優勢?；诖?，作者在此以D380大孔樹脂為載體固定胰蛋白酶，以柱上循環方式定向降解膠原蛋白，然后通過超濾法進一步分離膠原蛋白制備均一分子量膠原蛋白多肽，并考察了以其為原料制備的交聯型血漿代用品的理化性能。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

大孔苯乙烯系弱堿性離子交換樹脂D380，天津南開大學樹脂有限公司；胰蛋白酶(1∶250)，美國Promega公司；乙腈、甲醇，色譜純，Merk公司；超純水(Millipore超純水儀制備)；牛骨源膠原蛋白，法國Rousselot公司；其余試劑均為市售分析純。

中壓水冷夾套層析柱(40 cm×3.5 cm)，上海滬西分析儀器廠有限公司；超濾系統(Labscale TM TFF)，美國Minipore公司；10 kDa、20 kDa超濾膜(Pellicon XL，10 cm×50 cm)，美國Biomax公司；e2695-2998型高效液相色譜系統、Ultrahydrogel 1000型凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm)、數據采集與分析軟件Empower 3，美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 胰蛋白酶的固定化

由于D380樹脂的功能基團為游離氨基，可以戊二醛為交聯劑進行胰蛋白酶的固定化。

將D380樹脂進行酸洗、水洗、堿洗預處理后，用蒸餾水洗滌至中性。浸泡在2%戊二醛溶液中，控溫37 ℃，8 h后取出樹脂并用蒸餾水洗滌至中性。向樹脂中加入2 mg·mL-1的胰蛋白酶溶液，于pH值8.0、37 ℃攪拌反應8 h。取出樹脂用蒸餾水清洗(除去未固定的游離酶)至OD280=0，裝于中壓水冷夾套層析柱，裝填體積為42 mL，用pH值7.0的0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液平衡。

1.2.2 膠原蛋白的柱上循環酶切

將10 mg·mL-1膠原蛋白溶液100 mL置于37 ℃水浴中，以5 mL·min-1流速將膠原蛋白溶液輸入中壓水冷夾套層析柱內，單次循環耗時10.5 min，層析柱柱套外接水浴箱循環水控溫37 ℃，收集柱后流出液，并采用凝膠過濾色譜法進行酶解過程監測分析。待前次膠原蛋白溶液進樣完成后，重復進樣所收集的柱后流出液。

1.2.3 膠原蛋白酶解液的超濾分離

膠原蛋白經柱上固定化胰蛋白酶循環酶切后，可有效實現大分子膠原蛋白向小分子膠原蛋白的轉化，但分子量分布范圍寬，在5～100 kDa范圍內呈不均一無規則分布。因此，采用超濾法對膠原蛋白進行分離，工藝流程如圖1所示。

圖1 膠原蛋白酶解液的超濾分離工藝流程

將膠原蛋白酶解液經0.45 μm濾膜過濾后，采用超濾系統對濾液進行超濾。首先用截留分子量為20 kDa的超濾膜過濾，操作條件為：進口壓力25 psi(0.17 MPa)、循環口壓力10 psi(0.069 MPa)、截流比2∶1、溫度37 ℃，收集透過液1；再在相同操作條件下用截留分子量為10 kDa的超濾膜對所收集透過液1進行二次超濾，收集截留液2并進行凝膠過濾色譜分析。

在迫于市場競爭和人才競爭的壓力情況下，我國許多酒店的管理者已經認識到“重視人才、留住人才”的重要性，但偏偏采取的所謂“激勵”措施不夠人性化，繼而導致員工頻繁跳槽。

凝膠過濾色譜分析條件：流動相為pH值7.0的0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液，流速為 0.5 mL·min-1，DAD檢測器全波長掃描，檢測波長214 nm，柱溫37 ℃，上樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 酶固定化結果

殘留酶的去除是胰蛋白酶直接酶解膠原蛋白工藝的難點，特別是在對殘留酶較為敏感的應用(如傷口輔料、組織工程材料和化妝品等)中，殘留酶的去除尤其重要。由于胰蛋白酶(球形蛋白，2.3 kDa)與大分子膠原蛋白多肽(線性蛋白，14～18 kDa)之間存在峰重疊(圖2)，當大分子膠原蛋白多肽進一步降解后，峰重疊將更為顯著，導致后續分離困難。

圖2 大分子膠原蛋白多肽與胰蛋白酶的凝膠過濾色譜

為此，本實驗采用固定化胰蛋白酶降解膠原蛋白，以在溫和條件下提高酶解膠原蛋白的純度和安全性。

參照文獻[12-14]，以酶活為評價指標，針對性地對戊二醛濃度、載體與酶比例、固定化條件等酶固定化參數進行研究。結果發現，酶活回收率為41%，固定化酶在4 ℃放置60 d后可保持79%的活性。

2.2 柱上循環酶切結果

膠原蛋白柱上循環酶切結果如圖3所示。

S0為初始膠原蛋白 S1～S4分別為第1～4次循環酶切后的膠原蛋白

不同于胰蛋白酶等常規蛋白，膠原蛋白中不含色氨酸，在280 nm處無特征吸收。對膠原蛋白循環酶切流出液進行DAD檢測分析，在280 nm處未檢測到胰蛋白酶特征峰。表明，以D380樹脂為載體的固定化胰蛋白酶可溫和定向降解膠原蛋白，3次柱上循環酶切后，目標肽收率達到最高，含量較初始膠原蛋白提高70%以上。

2.3 超濾分離結果

膠原蛋白多肽及超濾液的凝膠過濾色譜如圖4所示。

經計算，目標肽總收率為23%。由于酶解可使初始膠原蛋白中部分大分子非目標肽降解為目標肽，目標肽相對收率可達174%。

采用多角度激光散射法[15-16]，得到目標肽數均分子量Mn為15 600 Da；累積分布曲線中10%和90%處的分子量M10和M90分別為8 300 Da和21 000 Da。表明，超濾法制備的膠原蛋白多肽具有良好的分子分布形態和分子量均一性。

2.4 均一分子量膠原蛋白多肽制備的血漿代用品的理化指標

膠原蛋白多肽在不同領域應用時，除了取決于蛋白質特定的化學結構、分子量大小和分布，還取決于其特定的空間結構，因此通常情況下還需對膠原蛋白多肽進行修飾或交聯處理，針對性地改變其表面分子電荷分布、等電點和網狀分子聚集結構等；膠原蛋白多肽分子內或分子間的的交聯則可以改變纏繞方式和分子構型、減少自由氨基含量、降低等電點、形成多聚體、增大膠體滲透壓、形成網狀固態可控結構等。

以均一分子量膠原蛋白多肽為原料制備交聯型血漿代用品[17]，其相關理化指標如表1所示。

a.一次超濾 b.二次超濾 c.初始膠原蛋白與目標肽

表1

以膠原蛋白多肽為原料制備的血漿 代用品的理化指標

Tab.1 Physicochemical indexes of plasma substitute usingcollagen polypeptide as material

理化指標初始膠原蛋白交聯產品酶膜耦合產品對照商品(polygeline)等電點5．34．75．44．8凝固點/℃28<4<4<4相對黏度/(mPa·s)4．23．12．52．9膠體滲透壓/mmHg26291431數均分子量Mn/Da58500285001560028000

由表1可知，所制備的血漿代用品具有適宜于體內應用的理化指標和有效性。

2.5 討論

分子量均一的膠原蛋白需進一步通過交聯、修飾和包埋等進一步處理，改善其理化性質后應用于體內。雖然通過修飾劑/交聯劑的調整和優化，可以有效調控目標產物的理化性質，但如果能在分子量均一的膠原蛋白多肽的基礎上進行調整和優化，其產物可控性和終產物的均一性均能得到一定改善。針對不同的應用和原料來源，通過優化工藝流程中的循環酶解條件、優選超濾膜分離組件有可能獲得具有均一分子量的膠原蛋白多肽。

3 結論

為得到均一分子量膠原蛋白多肽，首先用固定化胰蛋白酶對膠原蛋白進行柱上循環酶切，經過3次柱上循環酶切后目標肽收率達到最高，含量較初始膠原蛋白提高70%以上；然后采用超濾法對酶解液進行分離，膠原蛋白多肽數均分子量達到15 600 Da，具有良好的分子分布形態(M10=8 300 Da，M90=21 000 Da)，目標肽總收率為23%，相對收率為174%。將制備的均一分子量膠原蛋白多肽用于交聯型血漿代用品的制備，產品具有理想的體內應用理化指標。通過優化膜分離組件與循環酶解條件，可制備適用于不同原料來源和不同應用需求的均一分子量膠原蛋白多肽。

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Preparation of Collagen Polypeptide with Homogeneous Molecular Weight by Enzyme Membrane Coupled Method

LI Yun1,2,SHAO Yan1,2,ZHOU Wan1,3,LIU Lu1,3,TANG Song-shan4,LIU Tao1,4*

(1.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofPharmaceuticalBioactiveSubstances,InstituteofPharmaceuticalBioactiveSubstancesResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2.SchoolofChineseTraditionalMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;3.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 4.SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Inordertoobtaincollagenpolypeptidewithhomogeneousmolecularweights,thecollagenwascyclicallydigestedwithimmobilizedtrypsinonachromatographycolumn.Afterthreerecyclesofenzymedigestion,theyieldoftargetpeptidewasthehighest,anditscontentincreasedover70%comparedwiththeinitialcollagen.Theenzymatichydrolysatewasfurtherseparatedbyanultrafiltrationmethod.ThecollagenpolypeptidewithMn15 600Dawaspreparedsuccessfully,andithadgoodmolecularweightdistribution(M10=8 300Da,M90=21 000Da).Theyieldoftargetpeptidewas23%,andrelativeyieldwas174%.Thepreparedcollagenpolypeptidewasusedforthepreparationofcrosslinkingplasmasubstitutes,andtheproductsshowedsuitablephysicochemicalcharacteristicsin vivo.Throughoptimizingmembraneseparationmoduleandenzymolysiscycliccondition,collagenpolypeptidewithhomogeneousmolecularweightsappliedtodifferentmaterialoriginsandutilizationscouldbeprepared.

collagenpolypeptide;immobilizedenzyme;ultrafiltration;homogeneousmolecularweight

國家自然科學基金青年基金資助項目(21206020)，廣東省公益研究與能力建設專項資金資助項目(2014A010107027)，廣東省自然科學基金資助項目(2014A030313589，2015A030313843)

2016-10-13

李蕓(1992-)，女，江蘇淮安人，碩士研究生，研究方向：生物活性藥物；E-mail：liyun19920110@163.com；通訊作者：劉濤，副研究員，E-mail：tliu@foxmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.02.006

R 917

A

1672-5425(2017)02-0025-04

李蕓，邵炎，周婉，等.酶膜耦合法制備均一分子量膠原蛋白多肽[J].化學與生物工程，2017，34(2)：25-28，32.