鹽酸克倫特羅完全抗原的鑒定

陳藝宏，張琛卿，賀延志，張宏，王玉帥，李昊

（福州大學生物科學與工程學院，福建福州350108）

鹽酸克倫特羅完全抗原的鑒定

陳藝宏，張琛卿，賀延志，張宏，王玉帥，李昊*

（福州大學生物科學與工程學院，福建福州350108）

為制備并鑒定鹽酸克倫特羅（CLB）完全抗原CLB-BSA，采用重氮法將鹽酸克倫特羅（CLB）和牛血清白蛋白（BSA）進行偶聯，通過SDS-PAGE凝膠電泳、紫外全波長掃描、傅里葉紅外光譜法等進行鑒定，現有鹽酸克倫特羅完全抗原鑒定方法未曾采用過傅里葉紅外光譜法。結果表明：本方法成功地制備了完全抗原，偶聯比在9～13。通過投料比與偶聯比關系的探究，可知當CLB與BSA的投料比例小于80∶1時，偶聯比隨著投料比例的增加而升高，但當投料比大于80∶1時，偶聯比反而下降，為了節約成本，投料比應控制在80∶1以下。

鹽酸克倫特羅；完全抗原；制備；鑒定；偶聯比

鹽酸克侖特羅（Clenbuterol Hydrochloride，CLB）是一種β2-興奮劑，也稱為β2-腎上腺素受體激動劑。其與腎上腺素有著相同的藥效作用，主要用于支氣管哮喘、支氣管痙攣和阻塞性肺炎等疾病的治療。由于CLB有營養重新分配的效應，在1980年代初，一家美國公司開始在飼料中添加該物質。CLB能顯著提高瘦肉的轉化率，因此，β2-腎上腺素受體激動劑也被稱為“瘦肉精”。若人食用了含CLB的食物，在很長一段時間之后，可能會出現頭痛、胸悶、惡心等癥狀[1]。2007-2014年，由瘦肉精引起的食物中毒事件多達52起以上，主要集中于廣東、浙江、福建、湖南四省。瘦肉精中毒的食物來源主要是豬肉和豬內臟，最高添加量達到了280mg/kg[2]。

目前，用于檢測CLB的方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、酶聯免疫檢測法、膠體金免疫層析檢測法等方法，其中酶聯免疫檢測法、膠體金免疫層析檢測法是較為便捷的檢測方法，不但無需使用昂貴的儀器設備，而且檢測速度快，實用性強。2種檢測方法的原料主要是高效的免疫原和特異性強的抗體，CLB是一種小分子物質，無免疫原性，因此，需要和大分子蛋白載體進行偶聯獲得免疫原性。本文利用重氮法將小分子CLB與牛血清白蛋白（BSA）進行偶聯，通過各種鑒定方法，尤其是紅外光譜法，確證了偶聯的成功。此前紅外光譜法還未有過采用紅外光譜法鑒定鹽酸克倫特羅完全抗原的先例。由此獲得了完全抗原CLB-BSA，為進一步制備出高特異性抗體奠定了堅實的基礎。

1 試驗部分

1.1 材料

鹽酸克倫特羅標準品（含量99.0%），NaNO2、HCl、NaHCO3、Na2CO3、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4和KCl（分析純），牛血清白蛋白（BSA），淀粉碘化鉀試紙，福建藍昊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

pH計（PB-10A型），德國Sartorius公司；電子天平（FA1104N型），上海天平儀器廠；磁力攪拌器（90-1型），上海精科實業有限公司；電泳槽(Miniprotean 3型)，美國伯樂太平洋有限公司；恒壓恒流電泳儀（PowerPacTM Basic型），美國伯樂太平洋有限公司；凝膠成像系統（JS-680D型），上海培清科技有限公司；全波長掃描紫外-可見分光光度計（Cary 50型），美國瓦里安技術中國有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet 380），美國熱電公司；壓片機（YR-2型），上海山岳科學儀器有限公司；真空冷凍干燥機（FD-1A-50型），北京博醫康實驗儀器公司。

1.3 完全抗原CLB-BSA制備

1.3.1 重氮化反應

將0.3mol/L的鹽酸溶液和0.2mol/L的NaNO2在4℃中預冷0.5h；稱取3mg CLB標準品溶于預冷的1mL鹽酸溶液中，在冰浴中攪拌；將已預冷的0.2mol/L的NaNO2勻速滴加到CLB溶液中，反應過程中用碘化鉀淀粉試紙檢測，直至試紙變成深紫色為止才停止加入（應保持試紙在滴加后0.5～2.0s內讀試紙），之后繼續攪拌30min，反應過程中要避光和冰浴，且攪拌速度要保持低轉速，因為重氮鹽見光易分解，所以反應過程的避光尤其重要。反應式如圖1所示。

圖1 重氮化反應式

1.3.2 重氮偶聯反應

稱取40mg BSA溶于20mL pH9.5的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液中，將重氮化的CLB緩慢逐滴加入該溶液中。滴加結束后繼續在4℃條件下暗處反應24h，反應式如圖2所示。

圖2 重氮偶聯反應式

1.4 透析

反應結束后，將上述反應液取出裝入透析袋中，把透析袋兩側扎緊放入盛有1L PBS（0.01mol/L，pH7.4）的大燒杯中在4℃冰箱中透析，透析3d，每天換兩三次透析液；將離心后的CLB-BSA溶液置于真空冷凍干燥機凍干，凍干后置于4℃保存備用[3，4]。

1.5 SDS-PAGE法鑒定完全抗原CLB-BSA

各取10μL稀釋過的BSA溶液和CLB-BSA溶液至EP管，加入等體積的還原性樣品處理液，將其和含蛋白Marker的EP管置于沸水中爆沸約3min，低速離心；分離膠濃度為12.5%；然后，將各管樣品處理液和蛋白Marker上樣；之后，用恒壓80V電泳30min后，改120V繼續電泳，當溴酚藍指示劑接近膠體底部時停止電泳[5，6]。

1.6 紫外全波長掃描法鑒定完全抗原

將BSA溶于0.01M pH7.4的PBS中，配置成0.5mg/mL的BSA溶液；將CLB溶于0.01M pH7.4的PBS中，配置成0.1mg/mL的CLB溶液；將偶聯物CLB-BSA溶于0.01M pH7.4的PBS中，配置成0.5mg/mL的CLB-BSA溶液；對BSA、CLB和偶聯產物CLB-BSA溶液進行200～400nm的紫外全波長掃描[5]。

1.7 傅里葉紅外光譜法鑒定完全抗原

稱取3份約200mg的KCl，每份分別加入2mg CLB、BSA和偶聯產物CLB-BSA（凍干粉），作為檢測樣品；取適量KCl，研磨成細粉末，壓成1～2mm厚的薄片，進行背景扣除；分別取適量的各樣品，研磨成細粉末，壓成1～2mm厚的薄片，進行紅外光譜掃描。

1.8 投料比與偶聯物偶聯比實驗

用不同投料比例制備完全抗原CLB-BSA，設置CLB與BSA的摩爾比分別為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1。用紫外可見分光光度計掃描CLB和BSA的最大吸收波長。將CLB和BSA分別在兩者的最大吸收波長下測得4個濃度-吸光值標準曲線，從標準曲線中取得相關系數（與摩爾消光系數成正比）。根據式（1）求取偶聯比[7]：

式（1）中，A294.9、A278為偶聯物CLB-BSA分別在CLB、BSA最大吸收波長下的吸光值；KCLB-294.9為CLB、BSA在其最大吸收波長下的相關系數；KBSA-278為BSA在其最大吸收波長下的相關系數；KCLB-278為CLB在BSA最大吸收峰波長處的相關系數；KBSA-294.9為BSA在CLB最大吸收峰波長處的相關系數。

2 結果與討論

2.1 SDS-PAGE電泳法鑒定完全抗原CLB-BSA

重氮化的CLB可以通過偶氮鍵與蛋白載體酪氨酸殘基上的酚羥基鄰位相連并形成穩定的偶合物。載體蛋白BSA的蛋白分子量約為66.446kDa，CLB的分子量為313.650kDa，BSA上有19個酚羥基殘基[8]，若偶聯反應成功，則一分子的BSA能偶聯上幾個甚至十幾個CLB分子，其分子量能增加上千個分子量。將載體蛋白BSA和偶聯產物CLB-BSA稀釋一定倍數進行SDS-PAGE凝膠電泳，如圖3蛋白電泳結果所示，CLB-BSA條帶指示的分子量比BSA的略有增加，說明小分子與載體蛋白的偶聯成功。

圖3 BSA和CLB-BSA的SDSA-PAGE凝膠電泳圖譜

2.2 紫外全波長掃描法鑒定完全抗原

對BSA、CLB和偶聯產物CLB-BSA溶液進行200～400nm的紫外全波長掃描，如圖4紫外全波長掃描圖譜所示，偶聯物CLB-BSA的波形與BSA和CLB的波形不同，CLB-BSA的最大吸收峰與CLB和BSA的最大吸收峰相比均略左移動，三者的最大吸收峰分別為275.0、294.9、278.0nm。說明CLB和BSA偶聯反應后，兩者的吸收峰產生了疊加效應，導致偶聯物的最大吸收峰與CLB和BSA相比產生了位移。根據這一圖譜的現象可以推斷CLB與載體蛋白BSA產生了偶聯反應，獲得了完全抗原CLB-BSA。

圖4 BSA、CLB、和CLB-BSA的紫外全波長掃描圖譜

2.3 傅里葉紅外光譜法鑒定完全抗原

將CLB、BSA和偶聯產物CLB-BSA（凍干粉）進行傅里葉紅外掃描，如圖5所示，對比BSA、CLB及兩者的偶聯產物CLB-BSA的圖譜可以看出，CLB在2 500～2 400/cm和1 120～700/cm有多個特征吸收峰，而BSA的紅外掃描圖譜上無此特征吸收峰，而偶聯產物在保留BSA特征吸收峰的同時，也具有在2 500～2 400/cm和1 120～700/cm的特征吸收峰。傅里葉紅外掃描圖譜結果證明，偶聯反應的產物同時具有CLB和BSA的特征吸收峰，說明了產物為CLB和BSA兩者的偶聯物。

圖5 BSA、CLB、和CLB-BSA的紅外掃描圖譜

2.4 計算偶聯比的相關系數

通過紫外全波長掃描，已知CLB的最大吸收峰為294.9nm，BSA的最大吸收峰為278nm，將CLB、BSA的梯度溶液在紫外294.9nm和278nm下測吸光度值，可作出4個標準曲線，如圖6所示。

圖6 （a） CLB在紫外294.9nm的標準曲線

圖6 （b） CLB在紫外278nm的標準曲線

圖6 （c） BSA在紫外278nm的標準曲線

圖6 （d） CLB在紫外294.9nm的標準曲線

根據偶聯比計算式（式1），可知要計算偶聯比需要先求得KCLB-294.9、KBSA-278、KCLB-278、KBSA-294.9的值，通過4個標準曲線的斜率可以計算出這4個相關系數，如表1所示。

表1 偶聯比計算的相關系數

2.5 物料比對偶聯物偶聯比的影響

由于載體蛋白上參與偶聯反應的位點是有限的，因此偶聯比不會隨著投料比的增加而無限增大，而BSA上能與重氮化CLB結合的位點只有19個，因此，為了節約成本，應考慮投料比與偶聯比的關系。將CLB與BSA的投料比（摩爾比）分別為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1，進行完全抗原的制備，根據式（1）計算出每組的偶聯比。如圖7所示，制備的偶聯產物的偶聯比在9～13，當CLB與BSA的投料比例小于80∶1時，偶聯比隨著投料比例的增加而升高，但當投料比大于80∶1時，偶聯比反而下降。原因可能是大量CLB競爭性地與BSA結合時，形成了空間位阻，反而不利于CLB與BSA的結合。因此，當利用重氮法偶聯CLB和BSA時，應該控制投料比在80∶1以下，以免浪費原料。

圖7 投料比與偶聯物偶聯比的關系

3 結論

CLB為小分子物質，無免疫原性，采用重氮法將CLB與BSA相偶聯制備完全抗原，并通過SDSPAGE凝膠電泳、紫外全波長掃描對制備結果進行了鑒定，初步證明了偶聯的成功。已有的CLB完全抗原鑒定方法中未見到采用傅里葉紅外光譜法的例子，因此，本試驗還對鹽酸克倫特羅完全抗原的制備情況進行傅里葉紅外光譜掃描，根據CLB、BSA和CLB-BSA的特征吸收峰的對比，有利地證明了CLB和BSA的成功偶聯。該方法制備的完全抗原偶聯比為9～13，通過投料比與偶聯比關系的探究，可以得出投料應控制在80∶1以下。

根據BF Erlanger所述，半抗原偶聯到載體上的數目在8～25作為免疫原較為合適[9]，而本方法制備的完全抗原偶聯比正好在這個范圍內，可以進而對動物進行免疫，制備CLB多克隆抗體和單克隆抗體，為研制檢測CLB的酶聯免疫試劑盒和膠體金免疫檢測試紙條奠定基礎。完全抗原的偶聯比對抗體的滴度有影響，但是最佳偶聯比目前還沒有定論。因此，后續的試驗將把各種不同偶聯比的CLB完全抗原對動物進行免疫試驗，從而確定最佳偶聯比。

[1]Ying Li, Pan Qi, Xiao Ma. Quick detection technique for clenbuterol hydrochloride by using surface plasmon resonance biosensor[J]. European Food Research and Technology, 2014,239(2):195-201.

[2]朱少暉,方月琴,嚴丹紅.我國2007年～2014年鹽酸克倫特羅食物中毒案例分析[J].國外畜牧學(豬與禽),2016,36(4):82-84.

[3]汪惠澤.鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備及其CiELISA檢測方法的建立[D].揚州:揚州大學,2012.

[4]Gabriel, Wafula, Khaemba. Development of monoclonal antibody and lateral test strip for sensitive detection of clenbuterol and related β2-agonists in urine samples[J]. Food and Agricultural Immunology, 2016,27(1):111-127.

[5]翁惠玲.三聚氰胺抗原優化與酶聯免疫方法的研究[D].福州:福州大學,2012.

[6]李昊,韓樂.氯霉素人工抗原合成的優化及多克隆抗體的制備[J].中國食品學報,2013,13(5):177-184.

[7]楊利國,胡少昶,魏平華,等.酶免疫測定技術[M].南京:南京大學出版社,1998:279-281.

[8]王廷華,李官成,ZhouXinFu.抗體理論與技術[M].北京:科學出版社,2013:74-76.

[9]Erlanger BF. The preparation of antigenic hapten-carrier conjugates: a survey[J]. Methods Enzymol, 1980,70(A):85-104.

Identification of Complete Antigen for Antibody Production Against Clenbuterol Hydrochloride

Chen Yi-hong, Zhang Chen-qing, He Yan-zhi, Zhang Hong, Wang Yu-shuai, Li Hao*
(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fujian Fuzhou 350118)

To prepar and identificate complete antigen of Clenbuterol Hydrochloride (CLB), a conjugate of Clenbuterol Hydrochloride (CLB) - Bovine Selllm Albumin(BSA) was synthesized by diazotization method, and identified by SDS-PAGE gelelectrophoreses, UV full-wavelength-scanning spectrum and fourier infrared spectroscopy. It haven’t been used fourier infrared spectroscopy to identificated complete antigen of Clenbuterol Hydrochloride(CLB) presently. The result showed that the complete antigen was prepared successfully, the conjugated ratio of CLB to BSA was between 9 to 13. By exploring the relationship of CLB/BSA in feed on and coupling ratio CLB/BSA, it was concluded that coupling ratio increased with the feed ratio, when feed ratio of CLB with BSA was less than 80∶1, but coupling ratio declined when the feed ratio was more than 80∶1. For saving the cost, the feed ratio should be controlled below 80∶1.

Clenbuterol hydrochloride; Complete antigen; Preparation; Identification; Coupling ratio

S859.84

A

2096-0387（2017）01-0005-05

陳藝宏（1991-），女，福建漳州人，在讀碩士研究生，研究方向：抗體篩選及應用。

李昊（1968-），女，，黑龍江齊齊哈爾人，博士，教授，研究方向：生物制藥技術、食品安全檢測技術、生物活性肽促進動植物干細胞增殖、抑制腫瘤細胞增殖的活性及機制研究。