重組人凝血因子Ⅷ細菌內毒素檢測方法研究

范林，劉曉民，黃潔，徐武，劉鑫

（1.四川大學生命科學學院，四川成都610041；2.成都蓉生藥業有限責任公司，四川成都610041）

重組人凝血因子Ⅷ細菌內毒素檢測方法研究

范林1，2，劉曉民2，黃潔2，徐武2，劉鑫2

（1.四川大學生命科學學院，四川成都610041；2.成都蓉生藥業有限責任公司，四川成都610041）

為建立重組人凝血因子Ⅷ細菌內毒素檢查方法，按《中國藥典》2015年版（二部）附錄收載的細菌內毒素檢查方法及指導原則開展試驗。結果表明，鱟試劑動態濁度法在適當的稀釋倍數下，重組人凝血因子Ⅷ細菌內毒素檢測方法準確可靠，可以用于對重組人凝血因子Ⅷ原液、半成品、成品的檢定，且不受人員、儀器和日期的影響。

細菌內毒素；重組人凝血因子Ⅷ；鱟試劑

據報道，我國的甲型血友病患者約10萬人，其中1萬人接受過凝血因子Ⅷ治療[1]。目前，市場上有國內廠家從血漿中提取生產的凝血因子Ⅷ和進口的重組凝血因子Ⅷ。受原料血漿的限制，血漿來源的凝血因子Ⅷ產量十分有限，進口重組凝血因子Ⅷ價格昂貴，一般血友病患者無法承受。因此，迫切需要國內重組人凝血因子Ⅷ自主生產的完成。在重組人凝血因子Ⅷ的生產過程中，對其質量控制方法的建立也迫在眉睫。其中，建立細菌內毒素檢測方法對控制產品的熱原很重要。因此，必須建立一個快速檢測細菌內毒素的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

移液器、動態試管儀、無熱原取樣瓶、反應管、無熱原玻璃試管、無熱原吸頭和螺旋震蕩器。細菌內毒素工作標準品（CSE，效價60EU/支，批號150601-201479，中國食品藥品檢定研究院），鱟試劑（TAL，靈敏度0.015～10EU/mL，批號1306212，湛江安度斯生物有限公司），細菌內毒素檢查用水（批號1403210，湛江安度斯生物有限公司）。重組人凝血因子Ⅷ原液、半成品和成品。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試品的最大有效稀釋倍數（MVD）

取重組人凝血因子Ⅷ原液、半成品和成品，用細菌內毒素檢查用水進行不同倍數稀釋，且每一稀釋倍數同時進行內毒素回收試驗，將回收率最接近100%的稀釋倍數確定為樣品的最佳稀釋倍數。

動態濁度法的鱟試劑靈敏度為0.03EU/mL（標準曲線的最低點），那么最大有效稀釋倍數MVD=L/λb=5/0.03=166倍。

1.2.2 可接受標準

取供試品，采用2.2中專屬性確認確定的最佳有效稀釋倍數進行稀釋，由2位操作人員分6d分別進行測定，每天各測定1次。通過儀器軟件自動計算出供試品溶液的內毒素含量和供試品陽性對照溶液的細菌內毒素的回收率。取2人共12次測定結果計算其相對標準偏差（RSD）。對測定結果進行方差分析，對人員和日期兩因素進行F檢驗。同時，用進口鱟試劑進行同樣確認。

|r|≥0.98，供試品陽性對照溶液的細菌內毒素回收率應在50%～200%范圍內。

1.2.3 可接受標準

（1）|r|≥0.98，供試品陽性對照溶液的細菌內毒素回收率應在50%～200%范圍內。

（2）RSD≤20%。經F檢驗后，人員和日期兩因素在α＝0.05水平上均對方法精密度無顯著性影響（P＞0.05）。

2 結果與分析

2.1 稀釋倍數試驗

表1結果表明，重組人凝血因子Ⅷ原液，在低倍數（10倍）稀釋時出現渾濁，為避免干擾試驗，最終選擇80倍稀釋作為重組人凝血因子Ⅷ原液的最佳稀釋倍數。

表2結果表明，重組人凝血因子Ⅷ半成品，在10倍稀釋時回收率超出50%～200%范圍，最終選擇40倍稀釋作為重組人凝血因子Ⅷ半成品的最佳稀釋倍數。

同一產品不同組分的樣品對試驗的干擾情況各有不同，因此試驗得出的稀釋最佳試驗倍數也有差異，若采用凝膠法來檢測，那么需要進行供試品干擾試驗，然后才能進行供試品檢測，但供試品的干擾試驗往往不是一次就能成功的[2]。而采用本方法只需要一次就能確定重組人凝血因子Ⅷ原液、半成品、成品的最佳稀釋倍數。

2.2 專屬性確認

表3結果表明，重組人凝血因子Ⅷ成品，在20倍稀釋時回收率已接近100%且趨于穩定，最終選擇20倍稀釋作為重組人凝血因子Ⅷ成品的最佳稀釋倍數。

2.3 中間精密度確認

表4結果表明，|r|≥0.98，供試品陽性對照溶液的細菌內毒素回收率在50%～200%范圍內；RSD≤20%。經F檢驗后，人員、儀器和日期三因素在α＝0.05水平上均對方法精密度無顯著性影響（P＞0.05）。

Study on Bacterial Endotoxin Test Method of Recombinant Human Coagulation Factor Ⅷ

Fan Lin1,2, Liu Xiao-min2, Huang Jie2, Xu Wu2, Liu Xin2
(1.College of Life Sciences, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041; 2.Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan Chengdu 610041)

In order to establish bacterial endotoxin test method of recombinant human coagulation factor Ⅷ, the test was carried out according to the bacterial endotoxin test method and the guiding principle in the appendix of Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition) (two). The results showed that under the appropriate dilution multiple, the bacterial endotoxin test method of recombinant human coagulation factor Ⅷ was accurate and reliable, can be used for verification of recombinant human coagulation factor Ⅷ solution, semi-finished products and finished products, which is not affected by personnel, equipment and dates.

Bacterial endotoxin; Recombinant human coagulation factor Ⅷ; Limulus reagent

表1 重組人凝血因子Ⅷ原液的專屬性確認

表2 重組人凝血因子Ⅷ半成品的專屬性確認

表3 重組人凝血因子Ⅷ成品的專屬性確認

R446.112

A

2096-0387（2017）01-0019-03

范林（1985-），男，四川德陽人，本科，研究方向：蛋白提取。