市售夏枯草飲片質量調查及評價標準研究

陳蕾，戴衍朋，王亮，曲永勝，王萌，周倩*

(1.深圳福田區中醫院，廣東 深圳 518034，2. 山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

【中藥與天然活性產物】

市售夏枯草飲片質量調查及評價標準研究

陳蕾1，戴衍朋2，王亮2，曲永勝2，王萌2，周倩2*

(1.深圳福田區中醫院，廣東 深圳 518034，2. 山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

為了對夏枯草飲片質量進行全面的評價和控制，對市售18批飲片進行了外觀性狀考察、TLC鑒別以及水分、灰分、浸出物檢測，建立了夏枯草飲片HPLC指紋圖譜和咖啡酸、迷迭香酸含量測定方法，并結合主成分分析和聚類分析方法用于對不同批次飲片的模式識別。結果表明，18批飲片外觀性狀均符合藥典標準，但少有符合傳統對優品夏枯草外觀的要求。TLC圖譜均可檢出迷迭香酸；水分、總灰分、浸出物含量均符合藥典要求；酸不溶性灰分除3批外，其余符合藥典要求，但不同批次間有較大的差異；指紋圖譜的整體相似度較高，批次間主要色譜峰峰面積和批次間咖啡酸、迷迭香酸的含量有較大差異。通過上述研究，對市售飲片質量有了初步了解，建議提高外觀評價標準，增加指紋圖譜質量評價指標。

夏枯草； 質量調查研究；HPLC；指紋圖譜；咖啡酸；迷迭香酸

夏枯草為唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL．的干燥果穗[1]，主產于湖南、安徽、浙江和江蘇[2]，因“此草夏至后即枯”得名，是臨床常用的一味中藥。其味辛、苦，性寒，歸肝、膽經，具有清肝明目、消腫散結等功效，主要含有三萜及其苷類、黃酮、有機酸和糖類等活性成分[3-4]。近年來，常用于治療甲狀腺腫大、淋巴結核、乳腺增生、肺結核、高血壓以及腫瘤等疾病[5-6]。隨著以夏枯草為原料的中成藥及保健品如夏枯草顆粒、夏桑菊涼茶等的相繼問世，該品種越來越受到人們重視，對其開展的研究也日益廣泛[7-9]，因此對其質量的控制就顯得更加關鍵。目前國內對夏枯草開展的研究多針對化學成分和藥理作用展開,質量評價集中在對指標成分的含量測定和指紋圖譜檢測方面[10-13]，缺乏對市售飲片系統全面的質量調查和評價研究。為了解市售夏枯草飲片質量，本研究收集了市售18批夏枯草飲片，參照2010年版中國藥典[1](以下簡稱藥典)要求對各項目進行了檢測。同時為了反映更多化學成分的相關信息，建立了夏枯草飲片HPLC指紋圖譜，并在該色譜條件下對咖啡酸和迷迭香酸兩個成分進行了含量測定，結合主成分分析和聚類分析方法用于對不同批次飲片的模式識別，為夏枯草的質量控制提供方法和數據支持。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀(Agilent G1315B PAD，美國)；十萬分之一電子天平(Sartorius R200D，德國)；LC-350A超聲波中藥處理機(濟寧市中區魯超儀器廠)。乙腈為色譜純；水為超純水；乙醇、甲醇、環己烷和乙酸乙酯等其他試劑均為分析純；迷迭香酸對照品(成都瑞芬思科技生物有限公司，批號331-39-5)；咖啡酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110831-200302)。

18批次夏枯草均為市售中藥飲片，產地分別為安徽、河南、廣東、山東和湖北，部分產地不詳。經山東省知名老藥工姜保生先生鑒定為唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL．的干燥果穗。

2 方法與結果

2.1 外觀質量考察

對收集的夏枯草飲片外觀性狀進行外觀質量考察。結果見表1。

2.2 迷迭香酸TLC鑒別

參照藥典“鑒別”項下方法，以迷迭香酸對照品對夏枯草飲片進行TLC鑒別，結果見圖1。由圖譜可見，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；但同時可見，不同批次夏枯草在TLC圖譜中，色譜行為表現出較為明顯的區別。

1，20為迷迭香酸對照品；2～19 分別為1～18號夏枯草樣品。圖1 夏枯草TLC圖譜Fig.1 The TLC chart for Prunellae Spica

2.3 水分測定

取供試品2 g，參照藥典附錄IX H水分測定法中的第一法(烘干法)進行測定。結果測得夏枯草水分質量分數在9.12%～9.93%之間，均符合藥典不得過14.0%的規定。結果見表1。

2.4 總灰分測定

取供試品粉末(過二號篩)3 g，參照藥典附錄Ⅸ K灰分測定法中的總灰分的測定法進行測定，計算總灰分含量，結果，測得夏枯草總灰分質量分數在1.12%～9.75%之間，均符合藥典不得超過12.0%的規定。測定結果見表1。

2.5 酸不溶性灰分測定

取2.4項所得夏枯草總灰分，照藥典附錄Ⅸ K灰分測定法中的酸不溶性灰分的測定法進行測定，計算酸不溶性灰分含量。測得夏枯草酸不溶性灰分質量分數在0.04%～4.32%之間。共有3個批次不符合藥典不得高于4.0%的要求。測定結果見表1。

2.6 浸出物含量測定

取供試品約2 g，精密稱定，照藥典附錄X A 浸出物測定法中的水溶性浸出物測定法項下的熱浸法，采用水作為提取溶劑進行測定。以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的質量分數，結果測得水溶性浸出物質量分數在11.66%～18.90%之間，均符合藥典不得少于10.0%的規定。

表1 不同批次夏枯草質量檢查結果

2.7 夏枯草飲片HPLC指紋圖譜的建立

通過研究建立了夏枯草飲片HPLC指紋圖譜[14]，以期對所收集的飲片質量做出較為綜合和全面的評價。

2.7.1 色譜條件

Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～10 min，5%～18%A；10～35 min，18%A；35～40 min，18%～30%A；40～55 min，30%A；55～75 min，30%～100%A)；檢測波長210 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃。

2.7.2 對照品溶液的制備

取迷迭香酸和咖啡酸對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含迷迭香酸114.5 μg、咖啡酸3.1 μg的對照品儲備溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備

取各供試品粉末(過二號篩)0.25 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min，放涼，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.7.4 精密度實驗

取18號夏枯草樣品的供試品溶液，連續進樣5次，以迷迭香酸的保留時間和峰面積為參照，分別對各共有峰相對保留時間和相對峰面積進行統計。結果表明，各共有色譜峰的相對保留時間基本一致，相對標準偏差在0.00%～0.28%之間，相對峰面積相對標準偏差在0.00%～2.34%之間，表明夏枯草飲片指紋圖譜精密度實驗符合要求。

2.7.5 穩定性實驗

取夏枯草供試品溶液室溫保存，分別于0、3、6、12和24 h測定，以迷迭香酸保留時間和峰面積為參照，對各共有峰相對保留時間和相對峰面積進行統計。結果，各共有色譜峰的相對保留時間相對標準偏差在0.00%～0.36%之間，相對峰面積相對標準偏差在 0.00%～2.76%之間，表明夏枯草飲片指紋圖譜24 h內穩定性良好。

2.7.6 重復性實驗

取夏枯草粉末6份，照2.7.3項下方法提取測定，以迷迭香酸保留時間和峰面積為參照，對各共有峰相對保留時間和相對峰面積進行統計。結果表明，各共有色譜峰的相對保留時間相對標準偏差在0.00%～1.05%之間，相對峰面積相對標準偏差在 0.00%～2.98%之間，表明夏枯草飲片指紋圖譜重現性實驗符合要求。

2.7.7 咖啡酸和迷迭香酸線性范圍考察

精密吸取混合對照品儲備液，分別稀釋至儲備液濃度的0.1、0.2、0.4、0.7、1倍，制成系列標準溶液，依2.7.1項下方法進行測定，以峰面積A積分值(y)為縱坐標，對照品濃度(x，g·L-1)為橫坐標進行線性回歸處理，得咖啡酸的回歸方程為y= 30 613x+ 1.33，相關系數R為0.999 7，線性范圍為3.06×10-4g·L-1～3.06×10-3g·L-1，迷迭香酸的回歸方程為y= 40 492x+ 38.4，相關系數R為0.999 9，線性范圍為1.15×10-2g·L-1～1.15×10-1g·L-1。

2.7.8 迷迭香酸和咖啡酸加樣回收實驗

取夏枯草樣品(過2號篩)6份，分別精密加入迷迭香酸和咖啡酸對照品適量，按2.7.3項方法依法提取測定，計算回收率，結果二者平均回收率分別為99.34%和101.22%，相對標準偏差分別為2.19%和1.97%，說明該方法測定結果準確。

2.7.9 夏枯草飲片指紋圖譜測定

取搜集的各批次夏枯草飲片，分別制備供試品溶液，進樣。將所得圖譜以AIA格式依次導入國家藥典委員會編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”軟件。以1號夏枯草飲片色譜圖作為參照圖譜，進行指紋匹配。采用平均數法生成對照圖譜。夏枯草飲片HPLC指紋圖譜和對照圖譜疊加圖見圖2和圖3。18個批次飲片與對照圖譜之間的相似度均大于0.9。

通過統計指紋圖譜數據，18批次市售夏枯草飲片共有14個共有峰，保留時間分別為5.98、9.43、12.39、15.60、29.82、43.39、49.66、51.58、63.62、74.43、75.94、78.53、80.55、81.81 min。其中4號峰(15.60 min)為咖啡酸，6號峰(43.39 min)為迷迭香酸。各共有峰相對保留時間的相對標準偏差均小于3%，符合指紋圖譜的要求，但主要色譜峰的峰面積有一定的差異。

此外，通過指紋圖譜比較可見不同批次間成分比例關系有明顯不同，以峰面積響應值最大的6(迷迭香酸)和12號色譜峰為例，二者在絕大多數兩批次相比時均呈現出反比的趨勢，如圖3中所示。在一定程度上表明單一成分評價飲片質量是不全面的。

S1～S18為1～18號夏枯草樣品；R為對照圖譜。圖2 18批夏枯草飲片指紋圖譜色譜圖Fig.2 The overlapped HPLC fingerprints for Prunellae Spica

a1 S8；a2 S9；b1 S12；b2 S13。 圖3 批次間主成分峰面積比較疊加圖Fig.3 The overlapped chart for Prunellae Spica between different batches

2.8 主成分分析

通過SPSS 18.0 軟件中的因子分析對原始數據進行標準化處理。經過計算，前4個成分A1、A2、A3和A4的特征值大于1，即6.209、3.093、1.443、1.101，對總方差的累計率達84.538%，接近85%。故選擇A1、A2、A3和A4為第一、二、三和第四主成分。根據表2中信息，可見主成分一主要反映了來自原始色譜峰1、2、4、6 、7、8和14的信息，主成分二反映了色譜峰3、4、5、8、9、11的信息，主成分三反映了色譜峰10、11和13的信息，主成分四反應色譜峰12的信息。故用前四個主成分就可表示原HPLC數據的主要信息。根據主成分矩陣及變量的觀測值，計算各成分得分，繼而計算綜合主成分得分，結果見表3。

表2 成分矩陣

表3 主成分因子得分及綜合主成分總得分表

2.9 夏枯草飲片指紋圖譜聚類分析

由表3中的1～4主成分的得分，運用SPSS 18.0 軟件對18 個批次夏枯草樣品進行系統聚類，采用組間平均數聯結法，以歐式平方距離對樣品聚類，得到聚類分析樹狀圖(圖4) 。根據聚類分析可以看出：S1、S3、S8、S11為一類；S9、S12、S13、S14、S15、S18為一類；S4、S7、S16為一類；S2、S6、S17為一類；S10為一類；S5為一類。通過分析可見，分類并未表現出明顯的地域特征。聚類判別結果( 圖5) 證明夏枯草聚類分析分類合理。

圖4 樣品系統聚類分析圖Fig.4 The cluster-analysis figure of the samples

圖5 聚類判別結果Fig.5 Clustering discriminant results

2.10 迷迭香酸和咖啡酸含量測定

在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，從標準曲線上計算出質量分數，計算樣品含量(以干燥品計)。測定結果見表4。

表4 夏枯草飲片中咖啡酸和迷迭香酸質量分數測定結果

由表4可見，不同批次間夏枯草飲片中咖啡酸和迷迭香酸的質量分數存在一定的差異，咖啡酸在0.011%～0.035%之間，迷迭香酸在0.09%～0.78%之間。藥典規定，迷迭香酸質量分數不得低于0.20%，有3個批次夏枯草飲片含量不符合要求。

3 結果與討論

藥典對夏枯草的性狀要求如下：圓柱形，略扁，呈淡棕色至棕紅色、體輕，氣微，味淡等。姜寶生先生對優品夏枯草的描述為：色以深黃色為最優，梗(非藥用部位)越短越好，無霉變、氣微、味淡。通過對收集飲片外觀性狀的觀察，發現18個批次中，顏色有棕色、淡棕色和棕黃色，以淡棕色居多，其他標準中除了個別批次梗偏長、氣味略重外，總體符合藥典要求，但無一個批次可達到傳統外觀對于優品夏枯草的要求，即外觀深黃色。傳統外觀質量評價標準是中醫藥寶貴經驗的總結，是目前單一化學成分和化學部位尚不能替代的評價標準，因此為保證臨床療效，對于外觀的要求建議應該進一步提高標準。

在鑒別、檢查和浸出物的檢測結果中，18批次飲片TLC圖譜均可檢測到迷迭香酸斑點，但批次間色譜行為(斑點大小、顏色)表現出較為明顯的區別。水分含量質量分數在9.12%～9.93%之間，總灰分在1.12%～9.75%之間，浸出物在12.39%～18.90%之間，均符合藥典中的要求(水分不得超過14.0%，總灰分不得超過12.0%，浸出物含量不得低于10.0%)。根據測定結果，建議在對夏枯草飲片做相應限度要求時，可較藥典標準適當提高。酸不溶性灰分有3批飲片略高于藥典不得高于4.0%的規定(分別為2號4.32%，5號4.23%和6號4.29%)，其余批次符合藥典要求。

本研究建立了夏枯草飲片HPLC指紋圖譜及同時測定咖啡酸和迷迭香酸含量的質量評價方法，方法學考察符合指紋圖譜基本要求。18批次夏枯草飲片共含有14個共有指紋峰，共有峰相對保留時間RSD 均小于3% ，表明其在HPLC 色譜的相對位置穩定，可作為定性鑒別的指標參數，相對含量部分成分存在差異(不同批次色譜峰峰面積差異較大，測得咖啡酸質量分數在0.011%～0.035%之間，迷迭香酸質量分數在0.09%～0.78%之間)，但其指紋圖譜的整體相似度較高，因此可以作為鑒別夏枯草質量的指標之一。此外，通過比較不同批次特征圖譜發現，指標成分含量較低的批次，其他成分卻可能表現較高的峰面積響應值，進一步表明飲片質量評價可加入指紋圖譜的要求，待檢測樣品應與標準圖譜基本一致，并檢出共有特征峰。

為了更好地從多角度綜合判斷飲片質量，本研究還引入了主成分分析和聚類分析的方法，將反映重要色譜指紋圖譜的多維多息特征用四個主成分來描述，信息損失少，且更加便于數據分析。

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Research on quality investigation and evaluation criteria of commercially available Prunellae Spica

CHEN Lei1，DAI Yan-peng2，WANG Liang2，QU Yong-sheng2， WANG Meng2，ZHOU Qian2 *

(1.Shenzhen Futian Hospital of TCM，Shenzhen 518034，China；2.Shandong Academy of Chinese Medicine，Jinan 250014，China)

∶ In order to evaluate and control their qualities completely，18 batches of Prunellae Spica were bought，and their appearances, TLC identification, the inspection of moisture, ash, extract content were carried out. Furthermore, the HPLC-fingerprint of Prunellae Spica, the determination; of caffeic acid and rosmarinic acid content and the pattern identification of different batches by principal analysis and cluster analysis have been established. The results showed that the appearance of each batch accorded with the standards of China Pharmacopoeia, but few of them could reach standard of superior grade product; rosmarinic acid could be detected from all batches by TLC; Moisture, total ash and extract content were in line with the requirements of Pharmacopoeia; Acid insoluble ash of all the batches except 3 of them could comply with the requirement of Pharmacopoeia, but there were rather big difference among various batches; the overall similarity of the fingerprints was high, but the chromatographic peak area and the content of the caffeic acid and rosmarinic acid existed rather big difference between batches. Through the research above, the quality of Prunellae Spica was preliminarily understood, and it is recommended to further improve the appearance evaluation criteria, and add fingerprint as a new quality evaluation index .

∶Prunellae Spica; HPLC fingerprints; caffeic acid; rosmarinic acid

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.002

2016-04-22

深圳市福田區衛生公益性科研項目(FTWS2014028)；山東省中醫藥科技發展計劃(2015-167)

陳蕾(1982—)，女，主管藥師，研究方向為臨床藥學、中藥炮制。E-mail：86208906@qq.com

*通信作者，周倩，女，助理研究員，研究方向為中藥炮制、中藥及復方活性成分與質量控制研究。E-mail：merveilleqq@163.com

R284.1

A

1002-4026(2017)02-0008-07