金鐵鎖糖基轉移酶PtT1的克隆與生物信息學分析

李 媛 李國棟 張愛麗 錢子剛

云南中醫學院中藥材優良種苗繁育工程中心，云南 昆明 650500

金鐵鎖糖基轉移酶PtT1的克隆與生物信息學分析

李 媛 李國棟 張愛麗*錢子剛*

云南中醫學院中藥材優良種苗繁育工程中心，云南 昆明 650500

目的：克隆金鐵鎖糖基轉移酶(PtT1)全長基因，并進行生物信息學分析。方法：根據轉錄組數據，克隆金鐵鎖PtT1全長cDNA，命名為PtT1，并通過生物信息學軟件對該基因進行蛋白結構預測和構建進化樹等分析。結果：克隆得到PtT1基因，其cDNA全長1529bp，ORF長1377bp，編碼458個氨基酸，相對分子質量為51.25KDa，等電點5.80，定位于線粒體，與同科植物香石竹糖基轉移酶基因DcT227具有很高的同源性。結論：成功克隆、分析了金鐵鎖PtT1基因，為金鐵鎖該基因的后續功能鑒定提供了基礎。

金鐵鎖；糖基轉移酶；生物信息學

植物中化合物的糖基化是一種很普遍的生理現象，是植物細胞維持代謝平衡的主要機制之一[1]。糖基轉移酶則是負責催化分子糖基化修飾反應的酶，其可將活性糖基從尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖(UDP-glucose)轉移至次級代謝物及植物內外源毒性物質等一系列植物小分子化合物受體中[2]。糖基化經常是次生代謝產物主要的后修飾方式，往往修飾合成途徑中的最終一步或幾步。植物三萜皂苷類次生代謝產物，往往都具有較高的藥理活性價值。其合成途徑可前體形成，骨架構建及后修飾等三個過程[3]。次生代謝產物結構的基本骨架形成之后，經過細胞色素P450 酶和糖基轉移酶等一系列關鍵酶基因的后修飾，最終形成眾多種類繁多的三萜皂苷[4]。

金鐵鎖來源于石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW. C. Wu et C. Y. Wu的干燥根[5]。主要分布在云南、貴州、西藏等省，為云南的道地藥材[6]，是云南白藥等中成藥的重要主要組成藥之一。其活性成分為齊墩果烷型的三萜總皂苷[7-8]，具有顯著鎮痛、抗炎等的藥理活性[9-10]。目前，參與金鐵鎖三萜皂苷合成途徑前體形成，骨架構建等過程的關鍵酶基因都已有報道[11-12]，而后修飾環節中的糖基轉移酶基因還未見報道。

鑒于此，本研究根據前期轉錄組數據，通過設計特異性引物克隆了一條金鐵鎖PtT1家族基因，命名為PtT1，并采用生物信息學軟件對其蛋白質理化性質、結構特征、功能及系統演化關系等進行了預測分析。結果將為金鐵鎖PtT1基因的功能鑒定研究奠定基礎，揭示金鐵鎖三萜皂苷的分子形成機制。

1 儀器與材料

1.1 植物材料 金鐵鎖采集于云南省麗江市，經云南中醫學院錢子剛教授鑒定為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C. Y. Wu。

1.2 儀器 高速冷凍離心機(eppendorf)；穩壓穩流電泳儀(BIO-RAD公司)；DYC-33A微型電泳槽(BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(BIO-RAD公司)；PCR反應擴增儀(BIO-RAD公司)；移液槍(范圍100～1000μL，20～200μL，0.5～10μL)(eppendorf)。

1.3 試劑 EastepTM總RNA提取試劑盒(普洛麥格生產批號：7020001018)； PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa生產批號：AK3201)；TransStart KD Plus DNA Polymerase(Trans生產批號：K10511)；薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(GENEray生產批號：1601G20)；pEASY-T1 cloning kit(Trans生產批號：I40914)； DL2000 DNA Marker(TaKaRa生產批號：A2101A)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 方法

2.1 引物設計 根據金鐵鎖轉錄組中糖基轉移酶基因序列，設計1對特異性引物PtT1-F: AAAAATGAAACACCAAGAAAAGCAG，PtT1-R: GATTGAAGAAACCAAAGAAGGGGGC。

2.2PtT1基因的克隆 按照EastepTM總RNA提取試劑盒(普洛麥格)說明書提取金鐵鎖根中的總RNA；并根據PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)說明書合成cDNA。以cDNA為模板使用TransStartKD Plus DNA Polymerase(AP301)通過PCR擴增目的片段。

表1 PCR反應體系

PCR反應條件：94℃、5min；94℃、30s;45℃、30s，68℃、2 min30sec，35個循環；68℃延伸10min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選取較亮的目的條帶進行回收純化，并將回收產物與1μL pEASY-T1 cloning kit(Trans)配成連接體系，熱激轉化到大腸桿菌感受態細胞后，涂布于含Amp+抗性的LB固體培養基上，37℃過夜培養。挑選白色單克隆進行菌液PCR鑒定，選取陽性單克隆過夜搖菌保種后測序。

2.3 金鐵鎖糖基轉移酶基因的生物信息學分析 在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網站上通過BLAST程序進行序列比對，應用 BioEdit翻譯為氨基酸序列，使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定開放閱讀框。并用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質相對分子質量等；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)軟件進行疏水性分析；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)工具預測PtT1蛋白的跨膜螺旋區；Signal 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)預測蛋白質信號肽；利用在線工具TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預測PtT1的亞細胞定位情況。使用PORTER對二級結構預測SWISS-MODEL(http://swissmodel. expasy.org/interactive/k5MUhF/models/)服務器對三級結構預測；然后使用MEGA 5.0軟件內置的NJ法構建系統進化樹。

3 結果與分析

3.1 金鐵鎖PtT1基因的克隆 以金鐵鎖根cDNA為模板進行PCR反應，擴增得到2000bp左右的片段。使用pEASY-T1載體通用引物對單克隆進行菌液PCR檢測為陽性克隆后送樣測序，結果表明擴增序列與轉錄組序列基本一致。見圖1。

3.2PtT1基因的生物信息學分析PtT1糖基轉移酶cDNA全長1529bp，ORF長1377bp，編碼458個氨基酸。通過Blastn比對分析可知與石竹科香石竹同源性最高，為81%。采用ProtParam工具預測PtT1編碼的氨基酸序列的蛋白質理化性質，從分析結果中可知PtT1的分子質量為51.25KDa，理論等電點為5.80；在組成糖基轉移酶的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占的比例最高，達到11.4%；PtT1的不穩定指數為37.19，為穩定蛋白；脂肪指數為90.44。采用ProtScale分析PtT1氨基酸序列的疏水性/親水性，結果顯示415左右位置有一個典型的親水性區域，見圖2。

利用TMHMM 2.0對PtT1蛋白進行跨膜結構預測。推測其不存在跨膜區域，該糖基轉移酶編碼的蛋白不屬于跨膜蛋白。見圖3

使用SignalP 3.0對PtT1蛋白質的信號肽進行預測，由神經網絡模型分析可判斷該蛋白不存在信號肽。隱馬爾夫模型進一步證實了金鐵鎖PtT1編碼的蛋白是非分泌蛋白質，沒有信號肽存在。將PtT1編碼的蛋白質序列輸入在線細胞定位分析工具TargetP 1.1服務器，分析表明目的蛋白的分泌途徑為線粒體型，即定位在線粒體上。

對糖基轉移酶PtT1的結構域進行預測，在190位到442位之間存在高度保守的結構功能域—UDPGT，即UDPGT家族成員共有的典型結構域。見圖4。

利用PORTER對金鐵鎖PtT1進行二級結構分析，該蛋白二級結構中α-螺旋(H)占44.32%，β-折疊(E)占12.45%，無規則卷曲(C)占43.23%，該蛋白質的二級結構屬于混合型。利用Swiss-Model Workspace對糖基轉移酶的蛋白質三維立體結構進行預測。見圖5。

將金鐵鎖PtT1與GenBank數據庫中17種植物的糖基轉移酶蛋白進行Clustal W比對分析后，利用MEGA 5.1中的Neighbor-Joining 方法，構建系統進化樹。結果表明金鐵鎖與同科植物香石竹聚為一類，親緣關系最近；其次與北柴胡、小麥、擬南芥等植物的親緣關系也比較接近，與蓖麻等植物中的PtT1親緣關系較遠。見圖6。

4 討論

糖基轉移酶催基因催化三萜皂苷骨架糖基化的反應，其通過催化生物物體內已活化的糖，連接到不同的受體分子上，對一系列化合物進行激活、抑制或者調節溶解度，從而參與植物體多種調控和代謝途徑。目前已發現的催化植物中天然產物糖基化的酶均屬于糖基轉移酶家族Ⅰ，其作用是將活性糖基從核苷糖(尿嘧啶核苷二磷酸糖)轉移到包括次生代謝物在內的多種植物小分子化合物受體上[13]。

目前，僅有少數幾個參與三萜皂苷生物合成的糖基轉移酶被報道[14-19]。本研究立足于金鐵鎖轉錄組測序數據，從金鐵鎖根中克隆得到一條糖基轉移酶基因PtT1，其cDNA全長1529bp，ORF長1377bp，編碼458個氨基酸。Blast比對分析可知與同科植物香石竹有較高的同源性，保守結構域分析顯示其具有UDPGT家族成員共有的典型結構域，說明所得糖基轉移酶蛋白具有較高的結構保守性。通過構建進化樹，發現該基因與香石竹、北柴胡、擬南芥等植物的親緣關系比較接近。為進一步研究金鐵鎖糖基轉移酶在大腸桿菌異源表達，三萜皂苷合成代謝途徑及其關鍵酶表達模式等研究奠定一定的基礎。

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Cloning ofPtT1 genes of Psammosilene tunicoides and Bioinformatics

LI Yuan LI Guodong ZHANG Aili*QIAN Zigang*

Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants, Yunnan University of Traditional, Chinese Medicine, Kunming 650500, China

Subject To clone the glycosyltransferase gene(PtT1) inPsammosilenetunicoides, and to analyze the bioinformation ofPtT1. Methods cDNA was reversely transcriped according to the Transcriptome Sequencing. The protein characteristics was analyzed and the phylogenetic tree ofPtT1 was constructed using the bioinformatics. ResultsThe 1529bp sequence inP.tunicoideswas obtained, which has a 1377bp ORF, encoding 458 amino acids. The protein molecular weight was51.25KD, with the isoelectric point of 5.80. The protein was located at mitochondria. ThePtT1 in P.tunicoides was most similar with DianthuscaryophyllusDcT227 by NCBI blast. Conclusions ThePtT1 in P. tunicoides was successfully cloned and analyzed, which provides the foundation for this gene function characterization.

Psammosilenetunicoides; Glycosyltransferase; Bioinformation

國家自然科學基金(NO: 81260609)；云南省教育廳重點項目(NO: 2015119)；云南省教育廳科學研究基金項目(NO:2015J101)。

李媛(1991-)，女，漢族，在讀碩士研究生，研究方向為中藥資源開發與利用。E-mail:365408783@qq.com

錢子剛(1962-)，男，漢族，教授，研究方向為中藥資源開發分子生物學。E-mail: qianzig@ailiyun.com；

張愛麗(1986-)，女，漢族，講師，研究方向為中藥資源開發分子生物學。

R914.1

A

1007-8517(2017)04-0023-04

2016-12-05 編輯：梁志慶)