食用植物油中DNA提取和基因檢測研究進展

吳 瓊，宋安東

(1.中檢集團 中原農食產品檢測(河南)有限公司，河南 鄭州 450003；2.河南農業大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002)

食用植物油是甘油與高級脂肪酸形成的酯，在常溫下呈液態。食用植物油與人們的日常生活和身體健康密切相關。但是，近年來，市場上不斷曝出轉基因植物油標識混亂和食用植物油摻假等現象，嚴重侵害了消費者的合法權益。食用植物油質量安全問題也成為了食品安全問題中的重要內容之一[1]。為了保障食品安全和保護消費者的合法權益不受侵害，必須對食用植物油的轉基因成分和真實性進行分析和檢測。

傳統的食用植物油分析方法主要有常規理化分析(如脂肪酸比例和過氧化值等)和儀器分析(如色譜、光譜等)。隨著分子生物學科的不斷發展和應用，以分子生物學理論為基礎建立的分析方法應運而生。分子生物學分析方法是以目標DNA為基礎的一類基因檢測方法。傳統分析方法是以植物的某種特定代謝產物為目標進行檢測，分子生物學分析方法可以避免傳統分析方法中的植物代謝產物會隨環境變化而發生改變，并具有準確、快速、操作簡單和靈敏度高的特點。

DNA具有良好的酸堿耐受性和熱穩定性，是分子生物學研究的基礎和前提。因此，利用分子生物學分析方法來檢測食用植物油中的基因，必須首先提取得到高質量的生物DNA后，再進行后續基因檢測。但食用植物油大多屬于深加工類產品，特別是高等級的精煉植物油，大多要經過脫膠、脫酸、脫色和脫臭等復雜的生產加工過程。經過精煉的食用植物油中，DNA破壞較嚴重，且含量極低[2]。因此，如何從食用植物油中提取到高質量的DNA，成為影響后續基因檢測成敗的關鍵因素。1997年，國外學者Pauli[3]等從粗制的大豆油中提取到了DNA。還有一些學者從橄欖油中也提取到了DNA，但由于粗制大豆油和橄欖油都不屬于精煉食用植物油，因此這些DNA的提取方法大多不適用于精煉食用植物油。1998年，Maja Hellebrand[4]等首次從精煉菜籽油中提取到了可用于后續基因檢測的DNA。食用植物油中的DNA提取技術從此飛速發展，長期以來，始終是國內外學者研究和關注的熱點問題，很多學者都在努力探索更加高效的DNA提取方法。2010年，Joana Costa[5]等利用改良試劑盒方法從精煉大豆油中提取到DNA。我國也有許多學者建立了食用植物油中DNA的提取方法。蔡翠霞[6]等也成功提取到食用植物油中的DNA。本文從食用植物油中DNA提取和基因檢測2個方面，通過對食用植物油中DNA的不同提取方法和基因檢測方法進行綜述，對比各種方法的優缺點，并展望該領域未來的發展趨勢。

1 食用植物油中DNA提取

1.1 食用植物油中DNA提取步驟

食用植物油中DNA的提取步驟主要包括樣品的裂解和DNA的純化，樣品的裂解是使樣品中的DNA游離于裂解體系的過程，純化則是使游離的DNA進一步與裂解體系中其他成分，如蛋白質、多糖、鹽和其他雜質徹底分離、去除的過程。裂解的方法主要有化學裂解法、酶裂解法和機械裂解法。純化方法較常用的是利用有機溶劑(如酚和氯仿)抽提后再沉淀出DNA以及利用DNA吸附材料(如吸附樹脂和磁珠)吸附DNA后再洗脫出DNA。不同DNA提取方法間的差異也主要是裂解和純化的方式不同，通過優化裂解與純化方式，可以改進食用植物油中DNA的提取方法，提高DNA的提取效率。

與其他物質不同，食用植物油是一類高度深加工的純化產品，油脂類物質含量很高，DNA破壞較嚴重，且含量很低。因此，在食用植物油的DNA提取過程中，通常需在樣品的裂解步驟前對樣品先進行前處理，去除其中的油類物質，盡可能從油中分離出更多的殘留DNA。目前，較常用的前處理方法是乳化法。通過乳化處理可將食用植物油中的DNA更加充分地保留在水相中，使DNA與裂解體系充分相溶，常用的乳化劑為正己烷。Clarissa Consolandi[7]等使用正己烷處理橄欖油，充分乳化后，再通過酶法裂解DNA，最后利用多重PCR對提取的DNA進行檢測。程紅梅等[8]利用實驗室自制的試劑盒法提取大豆油中的DNA時，也采用正己烷對樣品進行前處理，提取得到高純度的DNA。此外，白立群[9]等還利用冷凍干燥技術建立了一種新的精煉大豆油DNA提取方法。

1.2 食用植物油中DNA提取方法

1.2.1 十二烷基磺酸鈉(SDS)法

十二烷基磺酸鈉(SDS)是一種陰離子去污劑，在高溫條件下可裂解細胞，使蛋白質變性，同時，還可與多種糖類和蛋白質等物質形成多重物，使DNA與其它物質分離，通過降低溫度和提高鹽濃度，使SDS多重物溶解度降低，蛋白質和多糖等物質發生沉淀，再對DNA進行純化。

SDS法最初主要應用于植物組織DNA的提取[10]。經過不斷的改良和優化，目前已成為較常用的DNA提取方法之一。1998年，Maja Hellebrand[4]等就利用SDS法從精煉菜籽油中成功提取到DNA。SDS法是一種較傳統的DNA提取方法，操作相對簡單，成本較低，也可提取到較完整的DNA。但在提取過程中通常用到的一些DNA純化試劑(如酚和氯仿等)有毒，對人體健康存在危害。同時，所提取的DNA含較多雜質。研究表明SDS法所提取的DNA質量不如CTAB法提取的DNA質量高[1]。建議可以進一步優化和改良DNA的純化方法，提高DNA的純化效果。許冬倩[11]等對SDS法中DNA的純化過程進行了改良，減少了DNA的損失，提取的DNA質量達到了后續基因檢測的要求。

1.2.2 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)是一種陽離子去污劑，能與DNA形成多重物，這種多重物在高鹽濃度的條件下可溶解并能穩定存在，但在低鹽濃度的條件下，因溶解度降低形成沉淀，大部分的蛋白質和多糖類物質仍溶解在溶液中。通過離心可將DNA多重物與蛋白質和多糖類等物質分離。再對DNA進行純化，去除CTAB，即可獲得DNA。

CTAB法也是一種較傳統的DNA提取方法。CTAB作為裂解液的主要成分不僅可以裂解細胞，還能有效去除各種雜質成分。通過優化裂解液的成分，可以更高效提取食用植物油中的DNA。國內外學者也基于此對CTAB法進行了不斷的改良。例如，研究發現在CTAB裂解液中加入巰基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等物質可以提高食用植物油中DNA的提取效果。Innocenzo Muzzalnpo[12]等就在CTAB裂解液中加入了巰基乙醇，得到了高質量的DNA，更好地用于后續的基因檢測。國內學者王亞[13]等也通過向CTAB裂解液中加入巰基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮，在食用植物油中取得了較好的DNA提取效果。CTAB法提取食用植物油中的DNA，成本相對較低，操作也比較簡單，是目前應用最廣泛的DNA提取方法之一。但CTAB法提取所用的時間較長，易造成DNA的損失，且提取過程的雜質也相對較多，同時，提取過程中用到的部分DNA純化試劑(如酚和氯仿等)有毒。與SDS一樣，CTAB法也需要進一步優化和改良DNA的純化過程，提高DNA的純化效果。

1.2.3 其他方法

在食用植物油DNA的眾多提取方法中，除上述兩種傳統方法外，還有很多DNA的提取方法，它們的基本原理都是根據不同的樣品裂解方式和不同的DNA純化方式來提取得到高質量的DNA。這些眾多不同的提取方法之間有很多相通之處，且各有優勢和不足，可以相互借鑒，取長補短。這些基于傳統的DNA提取方法而改良的眾多方法，具有準確、快速、操作簡單和靈敏度高等特點，應用越來越廣泛，但同時提取的成本也相對較高，通用性較低。

根據樣品裂解方式的不同，除SDS法和CTAB法外，異硫氰酸胍、聚乙烯吡咯烷酮和巰基乙醇等也是一些較常用的化學裂解物質，它們可與SDS法和CTAB法結合起來使用，這種改良可以更有效地去除各種雜質成分，提高DNA的提取質量。Simona Pafundo[14]等就利用含有異硫氰酸胍成分的裂解液提取得到了橄欖油中的DNA。徐偉麗[15]等在色拉油中采用含有異硫氰酸胍裂解成分的Wizard試劑盒法提取DNA，成功檢測到了目的基因。覃文[16]等也使用了Wizard試劑盒法在食用植物油中成功提取到了DNA。但是，國內也有研究者稱由于異硫氰酸胍能與大豆油互溶，因此，不能應用于大豆油中DNA的提取[17]。此外，酶裂解法中使用的蛋白酶K裂解成分，也可與SDS法或CTAB法同時使用，以提高食用植物油中的DNA提取效果。Innocenzo Muzzalnpo[10]等就使用CTAB法，在裂解液中加入蛋白酶K成分來提取DNA。

根據DNA純化方式的不同，除傳統的有機溶劑抽提外，較常用的方法還有磁珠法和離心柱法。磁珠法的原理是將裂解后游離的DNA分子吸附到磁性顆粒物質表面，形成DNA-磁珠結合物，而其他雜質類物質則留在裂解體系中，然后在磁場的作用下，磁性顆粒(DNA-磁珠結合物)與裂解溶液分開，最后用洗脫液將磁性顆粒上的DNA洗脫。磁珠法提取的DNA質量較高，提取過程耗時也較短，目前，已廣泛應用于各種深加工類食品中DNA的提取。Catherine[18]等比較了Wizard試劑盒中的磁珠、硅膠和羥基磷灰石3種不同吸附材料對橄欖油中DNA的提取效果，結果發現磁珠的提取效果更好。目前食用植物油中DNA的提取試劑盒主要原理就是磁珠法[19-20]。離心柱法是將樹脂或硅膠膜類材料固定在離心管中，在高鹽低pH的條件下，DNA被選擇性地吸附于離心管內的樹脂或硅膠膜上，通過離心去除裂解體系中的各種雜質，最后，在低鹽高pH的條件下，用洗脫液將DNA從樹脂或硅膠膜上洗脫。Joana Costa[5]等就是使用離心柱法從精煉植物油中成功提取到了DNA。

2 食用植物油中基因檢測

2.1 普通PCR法

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于體外微量擴增特定DNA片段的分子生物學技術。普通PCR法的檢測過程主要包括PCR擴增和電泳分析2個步驟。目前，普通PCR法已被廣泛應用在食用植物油中的轉基因成分檢測和摻假檢測中[21]。程紅梅等[8]對市售的10種精煉大豆油中的DNA進行了PCR檢測，檢出結果與樣品標識一致。此外，金紅等[22]也對2種大豆色拉油的DNA進行了PCR擴增，結果顯示有3種轉基因和大豆內源基因均出現了相應的擴增條帶，與產品標識一致，這說明普通PCR法可以檢測到食用植物油的外源基因。

普通PCR法是一種傳統的基因定性檢測方法。雖然，普通PCR法檢測基因快速、簡便且成本較低，對儀器條件要求較低，但普通PCR法在完成擴增目標基因后，通常要以瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增片段是否為預期的片段大小。但瓊脂糖凝膠電泳在DNA含量較低時，條帶亮度不強，影響結果判斷，并且片段大小是根據電泳后條帶的大致位置進行估計，難免存在偏差。并且容易污染，此外，電泳時使用的部分試劑有毒，危害人體健康，這些方面都限制了其在食用植物油轉基因成分檢測和摻假檢測方面的應用。

2.2 實時熒光定量PCR法

實時熒光定量PCR(qPCR)法，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累對整個PCR反應進程進行實時監控，通過與標準曲線的對比達到對未知模板的定量檢測。白立群等[9]對5種品牌的市售大豆油中DNA進行了實時熒光定量PCR檢測，結果均為陽性，與樣品標識一致。蔡翠霞等[6]也對11種食用植物油中的DNA進行了實時熒光定量PCR檢測，結果有7種植物油的擴增結果為陽性，與樣品標識一致。此外，王德蓮等[23]還利用實時熒光定量PCR法對摻有大豆油和棕櫚油的混合花生油進行了檢測，結果也檢測到了植物內源基因。

實時熒光定量PCR法具有靈敏度高、特異性強和再現性好等特點，與普通PCR法相比，qPCR法省去了在瓊脂糖凝膠電泳中鑒定DNA片段大小的步驟，不容易出現交叉污染，但對儀器條件要求較高。

2.3 環介導等溫擴增法

環介導等溫擴增(LAMP)法，是一種新型的DNA擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65 ℃恒溫擴增DNA片段，檢測過程主要包括恒溫擴增和產物檢測2個步驟。

環介導等溫擴增法是一種恒溫DNA擴增的方法，通常在恒溫水浴鍋中完成擴增過程，該方法在恒溫條件下，環介導等溫擴增法比普通PCR法高2～5個數量級[24]，具有操作簡單、特異性強、儀器條件要求較低，并且檢測成本也較低，結果的判斷也比較簡單，但是該方法的引物設計比較復雜，處理擴增產物時容易造成DNA的污染。此外，也存在產生假陰性的結果[6]。

2.4 多重巢式PCR法

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈式反應，使用2對PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物，它結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率會非常低，這種擴增方法提高了擴增過程的特異性和靈敏度。多重PCR法通過對多個不同位點基因進行同時擴增，大大提高了基因檢測效率。

多重巢式PCR法結合了巢式PCR的高靈敏度、高特異性和多重PCR的高通量特點，目前已廣泛應用于食用植物油的轉基因成分檢測中。王澎等[25]對轉基因大豆油的DNA進行檢測，通過多重巢式PCR擴增后檢測到了目的基因。

3 食用植物油中DNA不同提取方法比較

針對目前食用植物油中DNA的眾多提取方法，需要對不同的DNA提取方法進行整體對比和評價，欒鳳俠[26]比較了離心柱法和CTAB法對精煉食用植物油中DNA的提取效果，結果表明離心柱法的提取效果要優于CTAB法。Andreas Zimmermann[27]等也比較了SDS法、CTAB法和離心柱法等多種DNA提取方法在大豆深加工類產品中的提取效果，結果表明，離心柱法提取的DNA濃度較低，但純度卻較高，而SDS法和CTAB法雖然提取的DNA濃度較高，但純度卻較低。Angela Di Pinto[28]等也同樣發現，磁珠法和離心柱法與SDS法和CTAB法相比，提取的DNA純度較高。傳統的DNA提取方法雖然可以滿足后續實驗要求，且成本也較低，但提取過程耗時、費力，提取的DNA質量不高，且后續實驗用到的一些純化試劑有毒。磁珠法和離心柱法則更加安全、可靠，DNA的提取質量也相對較高。

近年來，國內外關于食用植物油DNA提取的研究報道中，使用了許多商品化的DNA提取試劑盒來提取DNA。磁珠法和離心柱法多為這些商品化的DNA提取試劑盒所采用，它們均采用獨特的緩沖液體系，省去了試劑的配制和酚、氯仿的抽提，減少了DNA的損失，操作安全、簡單而且高效，但提取的成本卻較高。目前，國外常用的試劑盒主要有The Wizard Magnetic DNA Purification System(Promega)for Food、The Qiagen QIAamp DNA Stool Extraction Kit和The NucleoSpin Food Kit。其中，The Wizard Magnetic DNA Purification System(Promega)for Food試劑盒是應用較廣的一種。Wu[29]等比較了Wizard磁珠純化試劑盒與傳統CTAB法對大豆油中DNA的提取效率差異，結果顯示利用試劑盒法提取DNA的效果更好。Michelangelo等[30]還比較了試劑盒法和改良CTAB法提取8種食用植物油中DNA的效果，結果發現試劑盒法可成功提取并檢測到DNA，而CTAB法則不能檢測到DNA。Joana Costa[5]等比較了The Wizard Magnetic DNA Purification System(Promega)for Food和The Nucleospin Food Kit兩種試劑盒對完全精煉后的食用植物油中DNA的提取效果差異，結果發現The Nucleospin Food Kit試劑盒能從所有精煉的食用植物油中提取到可用于基因檢測的DNA，而The Wizard Magnetic DNA Purification System(Promega)for Food試劑盒則不能，Zhang[31]等研究也同樣發現利用The Wizard Magnetic DNA Purification System(Promega)for Food不能從精煉大豆油中提取得到DNA。Rayda Ben Ayed[32]等還對The Qiagen QIAamp DNA Stool Extraction Kit試劑盒、Wizard基因組純化試劑盒和CTAB法在橄欖油中DNA的提取效果進行比較，結果發現The Qiagen QIAamp DNA Stool Extraction Kit試劑盒提取效果最好。Spaniolas[33]等通過比較3種不同DNA提取試劑盒對葵花籽油和橄欖油的提取效果，結果發現，The Qiagen QIAamp DNA Stool Extraction Kit試劑盒的DNA提取效果最好。此外，Simona[34]等還使用了Nucleo Spin Plant試劑盒成功提取到橄欖油中的DNA。目前，這些眾多的商品化DNA提取試劑盒通過對DNA提取過程中裂解和純化步驟的改良與優化，綜合了各種提取方法的優勢，使得食用植物油中的DNA提取過程變得更加高效。

4 結語

食用植物油中DNA的提取質量是影響后續基因檢測效率的關鍵因素，也是長期以來國內外研究的熱點。在食用植物油中DNA的提取方面，目前應用較多的是試劑盒法，雖然提取的DNA質量較高，但試劑盒的價格非常昂貴，且通用性較差，一些傳統的食用植物油中DNA的提取方法，包括基于此改良的一些新方法成本相對較低，操作過程也比較簡單，但提取的DNA純度較低，還需在DNA的純化方面有更進一步的研究。在食用植物油的基因檢測方面，普通PCR法的檢測結果容易受到精煉食用植物油中DNA的低含量和低完整度影響，容易出現假陰性，同時凝膠電泳過程中使用的一些試劑有毒；實時熒光定量PCR法雖然靈敏度高，但對人員和儀器條件的要求也較高；LAMP法對儀器條件的要求較低，但LAMP法的引物設計較復雜，也容易出現假陰性；多重巢氏PCR法的特異性好，但操作過程中容易出現交叉污染現象。因此，靈敏度高、特異性好、操作簡單和成本低廉的檢測方法仍需進一步的研究。相信隨著科學技術水平的不斷發展，未來的分子生物學分析方法將朝著低成本、高通用性和高靈敏度的趨勢發展。

[1]張海亮，吳亞君，陳銀基，等.食用植物油DNA提取方法的研究進展[J].食品與發酵工業，2010，36(11)：128-132.

[2]張娟，姚麗峰，譚嘉麗，等.精煉食用植物油中DNA高效提取方法[J].中國油脂，2010，40(s1)：126-129.

[3]Pauli U，Liniger U，Zimmermann A.Detection of DNA in soybean oil[J].Z Lebensm Unters Forsch A，1998，207:264-267.

[4]Maja H，Marion N，Jorg-Thomas M.Determination of DNA traces in rapeseed oil[J].Z Lebensm Unters Forsch A，1998，206:237-242.

[5]Costa J，Mafra I，Amaral J S，et al.Detection of genetically modified soybean DNA in refined vegetable oils[J].European Food Research and Technology，2010，230(6):915-923.

[6]蔡翠霞，肖維威，吳慧慧，等.植物油DNA的高效提取方法研究[J].中國油脂，2014，36(1)：69-72.

[7]Clarissa C，Luisa P，Marco S，et al.A procedure for olive oil trace ability and authenticity:DNA extraction，multiplex PCR and LDR-universal array analysis[J].Eur Food Res Technol，2008，227:1429-1438.

[8]程紅梅，彭宇發，金蕪軍，等.一種快速、簡便提取大豆油DNA的方法及轉基因大豆油的檢測[J].中國農業科學，2007，40(5)：1069-1072.

[9]白立群，吳亞君，韓建勛，等.一種有效的大豆精煉油DNA提取新方法—冷凍干燥法[J].食品與發酵工業，2009，35(12)：155-159.

[10]Thomas H T，Steven D T.A Rapid and inexpensive method for isolation of total DNA form dehydrated plant tissue[J].Plant Molecular Biology Report，1990，8(4):297-303.

[11]許冬倩，郝義波.一種有效的油脂DNA的提取方法[J]．食品研究與開發，2008，29(10):42-45．

[12]Innocenzo M，Massimiliano P，Enzo P.Detection of DNA in virgin olive oils extracted form destoned fruits[J].Eur Food Res Technol，2007，224:469-475.

[13]王亞.食用植物油DNA提取方法及轉基因成分檢測技術的研究[D].合肥：安徽大學，2007.

[14]Simona P，Matteo B，Caterina A，et al.Storage-time effects on olive oil DNA assessed by Amplified Fragments Length Polymorphisms[J].Food Chemistry，2010，123:787-793.

[15]徐偉麗，杜明，徐德昌.色拉油中轉基因成分的PCR檢測[J].生物信息學，2009，7(3):238-242.

[16]覃文，董潔，鄧鴻玲.實時熒光PCR定性定量檢測混合食用植物油中的花生油成分[J].中國油脂，2006，31(10):73-76.

[17]聞偉剛，崔俊霞，趙秀玲.大豆油中轉基因成分的Nested PCR和Semi-nested PCR檢測方法研究[J].生物技術通報，2005(6)：84-87.

[18]Catherine B，Delphine C，Isabelle M，et al.Comparative study of methods for DNA preparation form olive oil samples：possible forensic applications[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，2004，52:531-537.

[19]何景，許文濤，黃昆侖.食用植物油DNA提取及檢測技術的研究進展[J].食品工業科技，2012，33(12):382-386，391.

[20]Joana C，Isabel M，M Beatriz P P Oliveira.Advances in vegetable oil authentication by DNA-based markers[J].Trends in Food Science and Technology，2012，26(1):43-55.

[21]羅阿東，焦彥朝，曹云恒，等.食用植物油轉基因成分檢測技術的研究進展[J].食品工業科技，2012，33(9):470-472.

[22]金紅，程奕，趙昕,等.大豆色拉油中轉基因成分檢測技術研究[J].華北農學報，2004，19(1):24-27.

[23]王德蓮，覃芳芳，曾國權，等.PCR方法檢測花生油摻假研究[J].糧食與油脂，2014，27(6):56-59.

[24]何景，許文濤，黃昆侖.食用植物油DNA提取及檢測技術的研究進展[J].食品工業科技，2012，33(12):382-386，391.

[25]王澎，金麗晨，耿志明，等.食用大豆油中DNA的快速提取和轉基因成分定性檢測[J].江蘇農業學報，2008，24(6):940-943.

[26]欒鳳俠，張洪洋，白月.食用植物油中DNA高效快速提取方法及實時熒光PCR檢測技術的研究[J].中國油脂，2005，30(7)：41-43.

[27]Andreas Z，Jurg L，Urs P.Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples[J].Z Lebensm Unters Forsch A，1998，207:81-90.

[28]Angela D P，Vito T F，Maria Corsignano Guastadisegni，et al.A comparison of DNA extraction methods for food analysis[J].Food Control，2007，18:76-80.

[29]Wu Yajun，Chen Ying，Ge Yiqiang，et al.Detection of olive oil using the Evagreen real-time PCR method[J].Eur Food Res Technol，2008，227:1117-1124.

[30]Michelangelo V，Caterina A，Nelson M.Detection of plant oil DNA using high resolution melting (HRM) post PCR analysis:Atool for disclosure of olive oil adulteration[J].Food Chem，2013，141:3820-3826.

[31]Zhang M H，Gao X J，Yu Y B，et al.Detection of Roundup Ready soy inhighly processed products by triplex nested PCR[J].Food Control，2007，18(10):1277-1281.

[32]Rayda B A，Naziha G K，Fabienne Moreau，et al.Comparative study of microsatellite profiles of DNA from oil and leaves of two Tunisian olive cultivars[J]． Eur Food Res Technol，2009，229:757-762．

[33]Spaniolas S，Bazakos C，Spano T，et al.The potential of plastidtrn L(UAA) intron polymorphisms for the identification of the botanical origin of plant oils[J].Food Chem，2010，122:850-856.

[34]Simona P，Matteo B，Caterina A，et al.Storage-time effectson olive oil DNA assessed by Amplified Fragments Length Polymorphisms[J].Food Chem，2010，123:787-793.●