芒柄花黃素對人胃癌細胞株MKN-45增殖、凋亡的影響及其機制

董陳誠，鐘漓，張廣鈺，王振冉，冉福林，陳霄(廣西壯族自治區人民醫院,南寧5300；桂林醫學院附屬醫院)

芒柄花黃素對人胃癌細胞株MKN-45增殖、凋亡的影響及其機制

董陳誠1，鐘漓2，張廣鈺2，王振冉2，冉福林2，陳霄2
(1廣西壯族自治區人民醫院,南寧530021；2桂林醫學院附屬醫院)

目的 觀察芒柄花黃素對人胃癌MKN-45細胞株增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機制。方法 取對數生長期人胃癌MKN-45細胞分為A、B、C、對照組，A、B、C組分別加入20、 40、 80 μg/mL芒柄花黃素培養,對照組加入不含芒柄花黃素的完全培養基。采用MTT法觀察給藥24、48、72 h各組細胞增殖情況，計算細胞增殖抑制率。采用 DAPI染色法評價其對MKN-45細胞形態學的影響。采用Western blotting法檢測給藥48 h時各組細胞磷酸化IκB(p-IκB)及NF-κB p65。結果 隨芒柄花黃素濃度升高，細胞增殖抑制率升高，且隨干預時間增加，細胞增殖抑制率升高(P均<0.05)。給藥72 h時A、B、C、對照組的凋亡率分別為25.62%±2.57%、48.27%±3.18%、72.51%±4.35%、1.07%±0.54%，A、B、C組與對照組相比，P均<0.05。給藥48 h時A、B、C組細胞p-IκB、NF-κB p65蛋白相對表達量均高于對照組，且隨芒柄花黃素濃度升高，細胞p-IκB及NF-κB p65蛋白相對表達量增加，P均<0.05。結論 芒柄花黃素可抑制人胃癌MKN-45細胞株的增殖、促進細胞凋亡，其機制可能為芒柄花黃素激活NF-κB信號通路。

芒柄花黃素；胃癌；胃腫瘤；細胞增殖;細胞凋亡

胃癌是消化道疾病惡性腫瘤之一，腫瘤侵襲性、患者病死率均較高[1,2]。目前，化療、放療及手術治療在很大程度上提高了胃癌患者生存率[3]。常規化療藥物可降低腫瘤復發率，但存在毒性作用大、易產生耐藥性等缺點。近年來抗腫瘤藥物逐漸轉向于植物來源的天然化合物，這些天然藥物因其多靶點、多環節和多途徑的抗腫瘤作用，日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點[4～6]。芒柄花黃素分離自植物紅三葉草，為一種生物活性異黃酮，具有完善的生物功能和抗腫瘤作用[7]。研究發現其可通過激活p38 MAPK途徑和清除氧自由基發揮腫瘤作用[8,9]，但目前尚未見其對人胃癌MKN-45細胞NF-κB信號通路影響的報道。2015年6月～2016年4月，我們觀察了芒柄花黃素對人胃癌MKN-45細胞株增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人胃癌MKN-45細胞株購自中科院上海細胞生物所細胞庫。芒柄花黃素(純度>98.0%)：上海佳和生物科技有限公司。DMEM培養基購自Gibico公司。胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自上海拜力生物科技有限公司。細胞凋亡DAPI染色試劑盒購自上海臥宏生物科技有限公司。p-IκB、NF-κB p65和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購自Sigma-Aldrich公司。Series8000 直熱式CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)。DM IRB倒置顯微鏡(德國Leica儀器有限公司)。SpectraMax 190全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)。GelDoc 2000 伯樂凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。ECL 檢測系統(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 MKN-45細胞分組及芒柄花黃素給藥方法 取對數生長期人胃癌MKN-45細胞株，加入含10%胎牛血清、150 U/mL鏈霉素、120 U/mL青霉素的 DMEM 培養基中，37 ℃、5% CO2條件下常規培養傳代。待細胞貼壁生長良好時，經胰酶消化后在96 孔板中每孔加入 200 μL細胞液。培養 24 h 后將細胞分為干預組(A、B、C組)及對照組，A、B、C組分別加入20、 40、80 μg/mL芒柄花黃素培養(濃度參照文獻[9]), 對照組加入不含芒柄花黃素的完全培養基，將各組細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，備用。

1.3 各組細胞增殖情況觀測 采用MTT法。分別取給藥24、48、72 h各組細胞，接種于96孔板中。每孔加入 20 μL的MTT 溶液，持續孵育4 h，吸除上清液，然后加入150 μL的DMSO，37 ℃勻速搖床15 min。采用酶標儀檢測各組細胞在 490 nm 波長處的光密度值 (OD)。實驗重復5次，取平均值。采用GraphPad Prism 5.0軟件計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-OD干預組/OD對照組)×100%。

1.4 各組細胞凋亡情況觀察 采用DAPI染色法觀察各組細胞凋亡情況。取給藥72 h時各組細胞，吸盡培養液，用PBS漂洗5 min，之后DAPI工作液室溫染色15 min， PBS漂洗5 min，水溶性封片劑封片，最后置于熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化：早期凋亡細胞呈現核濃縮伴隨染色加深，或核染色質呈新月形聚集于核膜一邊；晚期的凋亡細胞則表現為核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細胞膜所包繞，即凋亡小體。凋亡率計算方法：在200×視野下隨機找5個視野觀測，每個視野計數200個細胞，以平均凋亡細胞數所占百分比作為細胞凋亡率，實驗重復5次，取平均值。

1.5 各組細胞磷酸化IκB(p-IκB)及NF-κB p65蛋白檢測 采用Western blotting法。取給藥48 h對數生長期各組細胞，采用BCA法提取細胞總蛋白。以3:1體積比與上樣緩沖液混合,取20μL蛋白樣品上樣。PVDF膜，轉膜1.5 h。含5%脫脂奶粉的PBS液封閉1 h，分別加入IκB抗體(抗體稀釋度1∶500)和NF-κB p65抗體(抗體稀釋度1∶500)，4 ℃緩慢搖動過夜，TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(抗體稀釋度1∶5 000)室溫反應1 h，超敏化學發光法顯色,凝膠分析系統分析記錄條帶光密度。用圖像分析系統分析,以積分光密度值表示相應目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 隨芒柄花黃素濃度升高，細胞增殖抑制率升高，且隨干預時間增加，細胞增殖抑制率升高，P均<0.05。各組細胞增殖抑制率比較見表1。

表1 不同給藥時間各組細胞增殖抑制率比較±s)

注：與前一給藥時間比較，#P<0.05。

2.2 各組細胞凋亡情況觀察 給藥72 h時A、B、C、對照組的凋亡率分別為25.62%±2.57%、48.27%±3.18%、72.51%±4.35%、1.07%±0.54%，A、B、C組與對照組相比，P均<0.05。給藥72 h時對照組細胞均勻分布，結構形態完好，胞質豐富。A組細胞體積皺縮變形，核收縮并且染色加深。B、C兩組細胞可見典型的細胞凋亡形態，胞核明顯固縮，呈致密的顆粒狀，核破碎明顯。

2.3 各組細胞p-IκB及NF-κB p65蛋白相對表達量比較 給藥48 h時各組細胞p-IκB及NF-κB p65蛋白相對表達量比較見表2。

表2 給藥48 h時各組細胞p-IκB及NF-κB p65蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，&P<0.05。

3 討論

芒柄花黃素是中藥紅三葉草的主要活性成分，在當歸及黃芪中也發現了該物質，具有明顯的植物雌激素特點。植物雌激素，有時也稱為飲食雌激素，因為結構相似于雌激素，它們可能產生雌激素或抗雌激素作用，已有研究報道芒柄花黃素具有保護心血管[10,11]、防治骨質疏松[12]、抗腫瘤[13，14]等植物雌激素作用。芒柄花黃素可防止血管生成和癌轉移，并在臨床中已用于轉移性結腸癌的治療[15]，還能在體內和體外通過多種途徑抑制腫瘤細胞株的生長及誘導其發生凋亡，例如非小細胞肺癌、卵巢癌及骨肉瘤等[16～18]，目前對于其抗腫瘤機制研究報道主要有激活p38磷酸化水平，抑制內源性Akt的磷酸化，降低細胞中Bcl-2蛋白水平及上調Bax表達，下調IGF-1/IGF-1R表達等[8,17,19]。

NF-κB是一類核轉錄因子，能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB序列特異結合，與癌癥、炎癥和自身免疫病等密切相關[20]。研究表明，NF-κB體系主要涉及機體防御反應、組織損傷和應激、細胞分化和調亡等的信息傳遞[21～23]。NF-κB信號通路的組成包括受體和受體近端信號接頭分子、NF-κB抑制劑IκB蛋白、IκB激酶(IKK)復合物和NF-κB二聚體[21]。在細胞中NF-κB與其抑制蛋白IκB家族成員結合成三聚體，以無活性的形式存在于細胞質中，只有被激活才從細胞質轉位于細胞核發揮重要作用。NF-κB通路經典途徑的激活是由上游IKK介導，當細胞受到促炎癥因子、病原體、氧化應激、生長因子等刺激后，會激活IKK并使IκB磷酸化，然后IκB發生自身多泛素化，并隨后被蛋白酶體降解[21]。IκB降解后解離出NF-κB，活化的NF-κB釋放并進入細胞核中與相應的靶序列結合可對相當多數量的基因發揮中心性轉錄調節作用[24，25]： NF-κB作為可誘導并普遍存在的轉錄因子，NF-κB能通過對腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素 1(IL-1)、IL-6、IL-8 和GM-CSF 等基因的誘導性調節, 參與免疫細胞的增殖、分化及所引起的免疫應答, 并起到中心調控作用。 NF-κB可通過對生長調節蛋白編碼基因的轉錄和表達的促進作用, 對細胞增殖進行調節。④多種病毒的啟動子與增強子之間都存在著NF-κB結合位點, 例如HIV、CMV 和SV40。目前，NF-κB在腫瘤細胞凋亡中的作用眾說紛紜，研究[26]證實NF-κB在腫瘤的生長,細胞凋亡等方面發揮關鍵作用，它的激活能提高腫瘤細胞的抗凋亡能力。近年來也發現NF-κB能調控下游因素，包括Bcl-2家族、IL-8、凋亡抑制蛋白(IAPS)家族、環氧合酶2(COX-2)、人類端粒反轉錄酶等在胃癌發生發展過程中及腫瘤耐藥中起重要作用[27]。而Ryan等[28]證實NF-κB，特別是其RelA(p65)亞基在p53介導的凋亡過程中具有重要作用-NF-κB失活或者活性降低可取消p53 誘導的凋亡。Huh等[12]認為, NF-κB p65 在胃癌早期中表達較高, NF-κB活化與淋巴浸潤呈負相關, 與胃癌患者總生存率呈正相關。兩種截然相反的結論, 說明NF-κB到底是誘導細胞凋亡還是抑制細胞凋亡也與多種因素有關，這也提示了我們NF-κB除了具有促癌作用還可能發揮抑癌作用。

本研究發現，芒柄花黃素對人胃癌MKN-45細胞有抑制增殖的作用，在同一時間段，隨芒柄花黃素濃度升高，細胞增殖抑制率隨之升高，在同一濃度，隨芒柄花黃素干預時間增加，細胞增殖抑制率升高，說明芒柄花黃素對人胃癌MKN-45細胞具有時間和劑量依賴性。腫瘤細胞從良性發展成惡性的主要原因就是細胞對生長因子信號的敏感性增強，同時細胞對凋亡程序調控的信號敏感性降低。我們使用DAPI染色實驗對細胞的凋亡情況進行觀察，結果發現藥物組的細胞凋亡率明顯比對照組高，且隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率也同時增高，這說明了芒柄花黃素能誘導細胞發生凋亡而抑制細胞增殖。凋亡，又稱程序性死亡，是由基因調控細胞衰老、維持機體正常運行的重要機制，由一系列細胞內外信號通路精密調控。各種凋亡信號通過信號傳導通路傳至細胞內，激活靶基因產生效應，引起凋亡[17]。經芒柄花黃素干預后的MKN-45細胞內p-IκB、NF-κB p65蛋白水平明顯地上調，這提示芒柄花黃素激活了細胞內NF-κB 信號通路，結合MTT及DAPI染色實驗結果，故我們推測芒柄花黃素激活MKN-45腫瘤細胞內NF-κB 信號通路進而誘導腫瘤細胞凋亡是其抗胃癌活性的作用機制之一。

綜上所述，芒柄花黃素可抑制人胃癌MKN-45細胞株的增殖、促進細胞凋亡，其機制可能為芒柄花黃素激活NF-κB信號通路。但NF-κB如何調控下游靶基因誘導腫瘤細胞凋亡還有待進一步研究。

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Effects of formononetin on proliferation and apoptosis of human gastric cancer MKN-45 cells

DONGChencheng1,ZHONGLi,ZHANGGuangyu,WANGZhenran,RANFulin,CHENXiao

(1People[′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To observe the effects of formononetin on the proliferation and apoptosis of human gastric cancer MKN-45 cells and its possible mechanism. Methods The human gastric cancer MKN-45 cells in the logarithmic growth phase were divided into groups A, B, C and the control group. Cells in the groups A, B and C were cultured and the culture medium was added with 20, 40 and 80 μg/mL of formononetin, respectively. The control group was not treated. The cell proliferation of MKN-45 cells was detected by MTT assay at 24, 48 and 72 h of formononetin treatment, and the growth inhibitory rate of MKN-45 cells was assessed. The effect of formononetin on morphological changes was evaluated using DAPI staining. The intracellular phosphorylated IκB (p-IκB) and NF-κB p65 protein expression was measured by Western blotting.Results MKN-45 cell proliferation was inhibited after being treated by formononetin with a time- and dose-dependent manner (allP<0.05). The apoptosis rates of groups A, B, C and the control group after 72-hour treatment were 25.62%±2.57%, 48.27%±3.18%, 72.51%±4.35% and 1.07%±0.54%, respectively (allP<0.05). The expression of p-IκB and NF-κB p65 protein in cells of groups A, B and C was significantly higher than that of the control group at 48 h after administration with a dose-dependent manner (allP<0.05).Conclusion Formononetin inhibits cell proliferation and induces apoptosis of MKN-45 cells, and the possible mechanism may be related to activation of NF-κB signaling pathway.

formononetin; gastric carcinoma; stomach neoplasms; cell proliferation; apoptosis

廣西高?？茖W技術研究項目(LX2014270)。

董陳誠(1981-)，男，醫學碩士，副主任醫師，主要研究方向為胃腸腫瘤外科。E-mail: 18282556@qq.com

鐘漓(1969-)，男，醫學碩士，副主任醫師，主要研究方向為胃腸腫瘤外科。E-mail: zhongli0302@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.002

R735.2

A

1002-266X(2017)07-0005-04

2016-09-11)