母乳成分在-80℃保存過程中的穩定性研究

方芳，李婷，司徒文佑，云戰友

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古呼和浩特010110）

母乳成分在-80℃保存過程中的穩定性研究

方芳，李婷，司徒文佑，云戰友

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古呼和浩特010110）

通過對母乳脂肪酸、維生素、活性成分以及pH值和酸度在超低溫冷凍條件下的穩定性研究，最終制定伊利母乳研究實物庫的母乳質量標準，以確保伊利母乳研究實物庫中的母乳樣本在-80℃保存過程中營養成分的損失率最小。試驗結果表明，母乳在-80℃冷凍保存12個月的過程中，隨著保存時間的延長，維生素含量顯著降低，脂肪酸、核苷酸含量以及pH值和酸度沒有發生顯著性變化。母乳-80℃保存3個月時，VB2和VA的含量分別減少為新鮮母乳的35%和29%，VC含量無法檢出；-80℃保存12個月時，煙酸含量減少為新鮮母乳的69%。因此，從現有檢測指標來看，母乳庫的質量標準應根據分析研究的母乳成分而定，若分析穩定性較差的營養成分如維生素盡量使用新鮮母乳。

母乳；成分；穩定性

2010年伊利集團建立了母乳研究實物庫，并制定了母乳實物庫管理規程，但母乳實物庫管理規程的建立主要是參考中英文文獻[1-3]，而文獻中的母乳庫是為了給沒有母乳喂養的嬰兒提供母乳的資源庫[4-5]，與我們建立的母乳實物庫進行母乳成分研究的目的不同。因此，文獻中母乳庫管理規程在我們實際應用時應通過大量的試驗加以修改，以保證母乳各營養成分在保存和試驗研究過程中，其含量不發生變化，確保母乳研究的準確性，最終達到伊利母乳研究實物庫的正常運行，保證在母乳研究時隨用隨取。因此，本文通過對母乳在-80℃保存過程中維生素和活性成分分析，了解母乳在超低溫冷凍過程中母乳成分含量的變化特點，針對不同的母乳營養成分，選擇不同保存時間的母乳進行研究，為制定伊利母乳研究實物庫的母乳質量標準奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳成熟乳（產后30 d～60 d）1 450mL；VA、VE標準儲備液（視黃醇）、VC標準溶液、VB1、VB2、VB3標準儲備液、脂肪酸甘油三酯標準品：購自Sigma公司；乙醇、無水硫酸鈉、氫氧化鉀水溶液、石油醚、正丁醇、鹽酸、鐵氰化鉀、三水乙酸鈉、冰乙酸、混合酶溶液、鹽酸、氫氧化鈉、異丙醇、高氯醇、庚烷硫酸鈉、乙酰氯、乙酰氯甲醇溶液、碳酸鈉溶液等試劑均為分析純；無水碳酸鈉甲苯為色譜純；50mL離心管。

1.2 儀器與設備

Waters1525高效液相色譜儀：上海魁元科學儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器：西安予輝儀器有限公司；UV-6000紫外分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；D3024R臺式高速冷凍型微量離心機離心機：呼和浩特市華拓儀器設備有限公司；AL204電子天平、Seven Excellence pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；THD-05恒溫熱水浴槽：寧波天恒儀器廠；Agilent7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳樣本的采集及處理

選取呼市地區足月分娩的健康產婦10人，進行母乳成熟乳（產后30 d～60 d）的采集，每個產婦的母乳采集量為145mL，冷藏運送至實驗室，母乳混合均勻后，按照所需樣本量進行分裝，所有樣本在采集或室溫凍融后2 h內檢測，檢測前將樣本混勻。

1.3.2 母乳成分含量測定

母乳VA、VE的檢測方法參考De Ruyter MG[6]和 SpeekAJ等[7]的高效液相色譜法進行檢測，母乳VB1、VB2、VB3的檢測方法參考Zafra-Gómez等[8]的高效液相色譜法進行檢測。母乳VC的檢測方法參考SpeekAJ[9]等的高效液相色譜法進行檢測。母乳脂肪酸的檢測方法參考Daxi Ren等[10-11]的高效液相色譜法進行檢測。母乳酸度和pH值的測定方法參考中華人民共和國國家標準GB 5413.34-2010《食品安全國家標準乳和乳制品酸度的測定》方法[12]進行檢測。

2 結果與分析

2.1 母乳脂肪酸在-80℃保存過程中的含量變化

母乳脂肪酸在-80℃保存過程中的含量變化見表1。

表1 母乳脂肪酸在-80℃保存過程中的含量變化Table1 Variation of fatty acid concentration in human milk during storage at-80℃for 12months

由表1的數據可以看出，母乳在-80℃保存12個月的過程中，飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量沒有顯著性差異。同時母乳中的各種不飽和脂肪酸含量（包括DHA、ARA、亞油酸、亞麻酸）在-80℃保存12個月的過程中均沒有顯著性變化，飽和脂肪酸中只有C12：0，C13：0和C10：0在-80℃保存12個月過程中有顯著性差異，其他飽和脂肪酸均未發生變化。母乳中的C12：0在保存12個月時，其含量顯著低于新鮮母乳及保存6個月和9個月的母乳含量；母乳中的C13：0和C10：0在保存12個月時，其含量顯著高于新鮮母乳及保存6個月和9個月的母乳含量。隨著保存時間的延長，母乳中一些脂肪酸含量增加，可能由于母乳中存在脂肪酶[13-17]，脂肪酶在超低溫冷凍保存過程中仍然有活性，因此脂肪會在脂肪酶的作用下將其分解為脂肪酸，導致脂肪酸含量的增加。本研究結果與其他文獻報道的結果較一致，M. Romeu-Nadal等[18]研究表明，母乳在-80℃保存12個月，DHA、ARA、亞油酸、亞麻酸、飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、n-3和n-6多不飽和脂肪酸的含量與新鮮母乳中的含量沒有顯著差異。

2.2 母乳維生素在-80℃保存過程中的含量變化

母乳維生素在-80℃保存過程中的含量變化見表2。

表2 母乳各種維生素在-80℃保存過程中的含量變化Table2 Variation of vitamins concentration in breast milk during-80℃storage of human milk

從表2可知，母乳在-80℃保存3個月時，VB2和VA的含量發生了顯著性的變化。母乳保存3個月時，VB2和VA含量減少為新鮮母乳的35%和29%，但3個月后，隨著母乳保存時間的延長，VB2和VA的含量沒有發生顯著性變化，只是含量略有減少。從目前現有國內外文獻查詢中，沒有找到有關母乳冷凍保存對母乳VB2和VA含量的影響。因此以上實驗數據證明，母乳中VB2和VA在保存過程中很不穩定，即使超低溫冷凍，也對其含量有較大損失。

母乳在-80℃保存過程中，VE含量呈現出逐漸減少的趨勢，但在保存12個月的過程中，其含量沒有發生顯著性變化。這與M.Romeu-Nadal[18]和Ramón Lacomba[19]等的研究結果一致，M.Romeu-Nadal等研究發現，母乳-80℃保存12個月α-生育酚和γ-生育酚的含量沒有改變。Moffatt等[20]同樣驗證了母乳-70℃保存16周，母乳中α-生育酚的含量與新鮮母乳相比沒有顯著變化。由此可知，母乳中VE含量在冷凍保存過程中非常穩定，不會發生顯著性變化。

母乳在-80℃保存9個月過程中，煙酸含量沒有發生顯著性變化，但是保存12個月時，其含量減少為新鮮母乳時的69%。從目前現有國內外文獻查詢中，沒有找到有關母乳-80℃冷凍保存對煙酸含量的影響。僅查到Beverly等研究[21]證明了母乳在-25℃保存3個月，生物素、煙酸、泛酸含量與新鮮母乳無顯著性差異。

母乳中VC含量較低，有的母乳在新鮮時甚至就無法檢出。同時，由于VC含量容易受到光照、氧化的影響，因此母乳在保存時應該格外注意。本次試驗發現，母乳保存3個月后，其含量便無法檢出。本研究結果與文獻結果不一致。M.Romeu-Nadal等[18]將母乳-80℃保存8個月，VC含量與新鮮母乳沒有顯著差異；-80℃保存12個月，VC含量下降了12%。本試驗結果與M.Romeu-Nadal的結果不同，可能由于本試驗母乳的VC含量較低引起，因此微小的變化就會引起顯著的差異。

2.3 母乳活性成分核苷酸在-80℃保存過程中的含量變化

母乳活性成分核苷酸在-80℃保存過程中的含量變化見表3。

由表3可以看出，母乳核苷酸總量及每一種核苷酸分量在-80℃保存過程中，其含量沒有發生顯著性變化。從趨勢上來看，核苷酸總量及其分量略有上漲趨勢，可能是由于母乳中存在核酸酶，冷凍狀態下核酸酶的活性較低，會少量的將寡聚核苷酸分解為核苷酸單體，造成每一種核苷酸含量的增加，導致核苷酸總量在保存12個月時有所增加。但這種變化不會引起樣本的顯著性差異，因為核酸酶只有在0℃以上，其活性才會大大增強。

表3 母乳核苷酸在-80℃保存過程中的含量變化Table3 Variation of nucleotide concentration in breast milk during-80℃storage of human milk

2.4 母乳酸度、pH值在-80℃保存過程中的含量變化

母乳酸度、pH值在-80℃保存過程中的含量變化見表4。

表4 母乳酸度和pH值在-80℃保存過程中的變化Table4 Variation of acidity and pH in breast milk during-80℃storage of human milk

由表4可以看出，母乳在-80℃，12個月的保存過程中酸度和pH值沒有發生顯著性變化。但是總體上，隨著母乳保存時間的延長，母乳酸度有所增加，而pH值沒有（增加或減少）的變化趨勢。文獻中沒有查到利用母乳酸度進行超低溫冷凍保存的穩定性研究實驗。查到的文獻中，我國謝恩萍等[22]在上海兒童醫學中心采集30例新鮮母乳，分別在0h（室溫）、48h（4℃）、72 h（4℃）、30 d（-20℃）、90 d（-70℃）進行了pH值跟蹤監測，發現新鮮母乳與-70℃保存90 d的母乳相比，pH值變化具有顯著差異性，但是-70℃保存90 d的母乳仍沒有發生變質，嬰兒可以食用。

3 結論

本研究對母乳在-80℃冷凍保存12個月的過程中的脂肪酸、維生素、活性成分以及pH值和酸度的變化進行了研究。研究發現，母乳在-80℃冷凍保存12個月的過程中，隨著保存時間的延長，維生素含量顯著降低，脂肪酸、核苷酸含量以及pH值和酸度沒有發生顯著性變化。因此該研究通過分析母乳易發生質量變化的成分或指標在-80℃不同保存時間的變化情況，找出了母乳中易變質成分在-80℃保存過程中的變化規律，我們今后將繼續進行母乳其他成分及活性成分在超低溫條件下的保存研究，結合文獻資料，最終綜合考慮，確定伊利母乳研究實物庫母乳質量標準，健全伊利母乳庫管理規程。

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Study on the Stability of Human Milk Components during-80℃Storage

FANG Fang，LI Ting，Mau Yau Szeto，YUN Zhan-you
（Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.，Ltd.，Hohhot010110，Inner Mongolia，China）

Based on the stability study of human milk vitamins and activity components in cryogenic freezing conditions，the quality standards of Yili Human Milk Physical Library were made to ensure the minimum loss of nutrients of the human milk samples stored in Yili Human Milk Physical Library at-80℃.The results showed that freezing at-80℃for 12months significantly reduced vitamins contents，did not significantly change fatty acid contents nucleotide contents and pH or acidity，compared with fresh milk.VB2and VAlevels were reduced to35% and 29%of fresh breast milk respectively at-80℃for3months，and VCwas not detected；nicotinic acid was reduced to69%of fresh breast milk at-80℃for12months.Therefore，from the existing test indicators，the quality standards of human milk freezing storage should be based on human milk composition analysed，if stable nutritional ingredients such as fatty acids can be used to store human milk at-80℃for 12months.

human milk；components；stability

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.002

2016-06-06

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B03）

方芳（1981—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：乳品營養。