正交設(shè)計(jì)與響應(yīng)面法優(yōu)化山藥多糖提取工藝

龍菊，孫翠英，張紅霞，王家順

（安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順561000）

正交設(shè)計(jì)與響應(yīng)面法優(yōu)化山藥多糖提取工藝

龍菊，孫翠英，張紅霞，王家順

（安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順561000）

采用微波纖維素酶法提取山藥多糖，并利用苯酚一硫酸法測(cè)定多糖的含量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法進(jìn)一步優(yōu)化工藝。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解時(shí)間64min、微波時(shí)間50 s，山藥多糖提取量為32.42mg/g。

山藥多糖；正交試驗(yàn)；響應(yīng)曲面法

山藥，又名薯蕷（Dioscorea japonica Thunb）。山藥作為一種食藥兩用的食品，營(yíng)養(yǎng)成分全面，含有豐富的碳水化合物和蛋白質(zhì)。具有增強(qiáng)免疫功能，降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等多種生理活性，對(duì)人體保持健康有重要的意義[1-3]。目前，多糖提取方法有微波輔助法、水提取法、超聲波輔助法和纖維素酶解法等，但提取時(shí)間較長(zhǎng)，提取率較低[4]。為了進(jìn)一步提高多糖提取率、縮短提取時(shí)間。本研究在單因素分析法的基礎(chǔ)上，利用正交設(shè)計(jì)及響應(yīng)曲面法，并采用微波纖維素酶法提取多糖，為山藥多糖提取提供一套快速、高效的方法，為開(kāi)發(fā)山藥類功能保健食品提供一定的工藝參數(shù)[5-10]。

1 材料與儀器

1.1 材料

山藥：安順劉管新鮮山藥。

1.2 試劑

纖維素酶：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚均為分析純。

1.3 儀器

AB204-N型電子天平：奧豪斯；752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)安捷倫；恒溫水浴鍋：沈陽(yáng)龍騰儀器有限公司；離心機(jī)：上海儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱：上海博訊有限公司；微量移液器：德國(guó)Brand；粉碎機(jī)：長(zhǎng)沙平凡有限公司；微波爐：美的電器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：寧波新芝儀器有限公司。

2 方法

2.1 山藥多糖提取工藝流程

山藥→干燥粉碎→稱量→蒸餾水溶解→微波水浴加熱→纖維素酶→滅活酶→水浴提取→離心取上清液→濃縮→山藥多糖

2.2 山藥多糖測(cè)定

精確稱取山藥粉（安順劉官山藥）1.0 g，加入蒸餾水10mL，用600W微波功率處理60 s，后再加入0.2%纖維素酶，在溫度50℃條件下酶解1 h，提取結(jié)束后抽濾提取液，用濃縮到適當(dāng)體積。按照苯酚一硫酸法，測(cè)定其吸光值，計(jì)算山藥多糖的含量。

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

利用苯酚一硫酸法，在最大吸收波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定葡萄糖吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.013 5x-0.258 3R2=0.999 6。當(dāng)測(cè)定多糖含量時(shí)，將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出所測(cè)溶液的多糖含量。

山藥多糖含量的計(jì)算公式：

2.4 微波纖維素酶法提取山藥多糖單因素試驗(yàn)

通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，選取微波法纖維素酶法提取山藥多糖提取量有顯著影響的4個(gè)因素，即微波功率、微波時(shí)間、纖維素酶量及酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察每個(gè)因子對(duì)多糖提取量的影響。

2.5 微波纖維素酶法提取山藥多糖多因素試驗(yàn)

2.5.1 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)以酶加量、酶解溫度、微波功率和微波時(shí)間，按L16（44）設(shè)計(jì)四水平四因素試驗(yàn)，16個(gè)組合，3次重復(fù)，確定山藥多糖的最佳提取方法，試驗(yàn)因子及水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因子及水平Table1 Testing factors and levels

2.5.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)（微波時(shí)間不顯著）的基礎(chǔ)上，選用響應(yīng)曲面試驗(yàn)法，綜合考慮做3因素（A微波功率W，B酶加量%，C酶解時(shí)間min）3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的曲面分析試驗(yàn)，響應(yīng)面分析因素與水平編碼表見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平編碼表Table2 Factors and levels of response surface experiment

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

3.1.1 不同微波功率對(duì)山藥多糖提取量的影響

通過(guò)設(shè)定微波時(shí)間60 s，纖維素酶加量0.2%，酶解時(shí)間1 h，微波功率為160、320、480、600、720、840W，不同微波功率對(duì)山藥多糖提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 微波功率多糖提取含量的影響Fig.1 Microwave power on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.2 不同纖維素酶量對(duì)山藥多糖提取量的影響

通過(guò)設(shè)定微波功率為600W，微波時(shí)間60 s，酶解時(shí)間1 h，纖維素酶加量為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.30%，不同纖維素酶加量對(duì)山藥多糖提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 纖維素酶加量對(duì)多糖提取含量的影響Fig.2 Cellulose enzyme concentration on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.3 不同纖維素酶酶解時(shí)間對(duì)山藥多糖提取量的影響

通過(guò)設(shè)定微波功率為600W，微波時(shí)間60 s，纖維素酶加量0.2%，酶解時(shí)間為20、30、40、50、60、70、80、90min，不同纖維素酶解時(shí)間對(duì)山藥多糖提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 纖維素酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)多糖提取含量的影響Fig.3 Cellulose enzyme digestion time on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.4 不同微波功率對(duì)山藥多糖提取量的影響

通過(guò)設(shè)定微波功率600W，纖維素酶加量0.2%，酶解時(shí)間1 h，微波時(shí)間為10、20、30、40、50、60、70 s，不同微波功時(shí)間對(duì)山藥多糖提取量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 微波時(shí)間對(duì)多糖提取含量的影響Fig.4 Microwave time on the influence of the content of the polysaccharide extraction

利用微波纖維素酶法的單因素試驗(yàn)，分別考察微波功率、維素酶加量、酶解時(shí)間和微波時(shí)間對(duì)山藥多糖提取率的影響。由（圖1～圖4）可知微波功率600W、纖維素酶加量為0.2%、纖維素酶反應(yīng)時(shí)間50min～70min，微波提取時(shí)間在30 s～50 s等單因素試驗(yàn)的條件下，山藥多糖的提取含量較高。

3.2 微波纖維素酶法提取山藥多糖多因素試驗(yàn)

3.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化山藥多糖的提取工藝。其正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果分析見(jiàn)表3，方差分析表見(jiàn)表4。

表3 正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果分析Table3 Orthogonal test and analysis of results

表4 方差分析表Table4 The variance analysis of the orthogonal trial

由表3可知，對(duì)山藥多糖提取量影響的因素為微波功率＞纖維素酶加量＞酶解時(shí)間＞微波時(shí)間。由表4方差分析表可知，微波功率和酶加量極顯著，酶解時(shí)間有一定影響，微波時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響較小。山藥多糖提取工藝的單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)果一致，得出最優(yōu)的工藝組合為10號(hào)（A3B2C4D3），微波功率為600W、纖維素酶加量為0.2%、纖維素酶解時(shí)間70min和微波時(shí)間50 s。

3.2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化山藥多糖提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)分析設(shè)計(jì)及結(jié)果表5，二次回歸模型的方差分析結(jié)果表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)分析設(shè)計(jì)及結(jié)果Table5 Design and result of response surface analysis

表6 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table6 Variance analysis of quadratic regression model

通過(guò)利用Design expert8.0軟件對(duì)表5進(jìn)行回歸分析，得到影響山藥多糖含量的3因素與響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)二次回歸方程模型：

由表6可知，該模型據(jù)極顯著（P＜0.01），擬合程度好（失擬項(xiàng)P＞0.05），誤差小，該模型相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 8＞0.9），表明該模型內(nèi)部試驗(yàn)點(diǎn)相關(guān)。由F值可知，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2極顯著。該二次方程能夠較好擬合真實(shí)的響應(yīng)面，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)山藥多糖的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

通過(guò)回歸方程分析結(jié)果作出兩因子交互作用的模型響應(yīng)面圖，圖直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)曲面的影響，微波功率與酶加量的交互作用圖5，微波功率與酶解時(shí)間的交互作用圖6，酶加量與酶解時(shí)間的交互作用圖7。

圖5 微波功率與酶加量的交互作用Fig.5 Interaction between microwave power and enzyme concentration

圖6 微波功率與酶解時(shí)間的交互作用Fig.6 Interaction between microwave power and enzyme digestion time

圖7 酶加量與酶解時(shí)間的交互作用Fig.7 Interaction between enzyme concentration and digestion time

微波功率與酶加量（圖5）的交互作用對(duì)山藥多糖提取率影響最大，曲面圖比較陡峭；其次是微波功率與酶解時(shí)間液料比與提取時(shí)間（圖6）、酶加量和酶解時(shí)間（圖7），曲面圖相對(duì)較平緩，響應(yīng)面的分析結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。利用design expert軟件對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行典型性分析后，山藥多糖最優(yōu)的提取條件為：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解時(shí)間64min。在上述優(yōu)化工藝條件下，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證山藥多糖的提取量達(dá)32.42mg/g。

3.3 正交試驗(yàn)與響應(yīng)曲面試驗(yàn)對(duì)比分析

通過(guò)正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面試驗(yàn)，其優(yōu)化后的工藝參數(shù)，兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表7。

表7 兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選結(jié)果對(duì)比Table7 Comparison of results between Box-Behnken design and orthogonal design

結(jié)果表明，響應(yīng)曲面法方程顯著性比較顯著，說(shuō)明其擬合成度好，能進(jìn)一步優(yōu)化山藥多糖提取的工藝參數(shù)。提高多糖提取含量，符合實(shí)際生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本，因此曲面響應(yīng)法為最佳提取工藝。

4 結(jié)論

以山藥為研究對(duì)象，利用微波纖維素酶法提取山藥多糖，在單因素和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以山藥多糖提取量為指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法對(duì)山藥多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。與正交試驗(yàn)相比，響應(yīng)曲面法考慮各因素水平間的交互作用，其穩(wěn)定性和工作量方面更簡(jiǎn)易、科學(xué)和合理。通過(guò)優(yōu)化的最佳提取條件為：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解時(shí)間64min、微波時(shí)間50 s，山藥多糖提取量為32.42mg/g。

[1]葛立軍,朱振洪,沙躍,等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取山藥多糖工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)藥,2010,21(12):3187-3188

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Extracting Process Optimization of Yam Polysaccharide by Orthogonal Test and Response Surface Methodology

LONG Ju，SUN Cui-ying，ZHANG Hong-xia，WANG Jia-shun
（College of Agriculture，Anshun University，Anshun 561000，Guizhou，China）

Yam polysaccharide was extraced by microwave-enzyme synergistic method and its content was determined by the method of phenol-sulfuric acid. Orthogonal test and response surface methodology were used to optimize the extraction of yam polysaccharide based on the results of single factor experiments. The results showed that the best extractive technique conditions were as follows：microwave power 662 W，enzyme concentration 0.2 %，enzyme digestion time 64 min，microwave time 50 s. And the content of extracted yam polysaccharide was 32.42 mg/g under the conditions.

yam polysaccharide；orthogonal design；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.012

2016-05-26

貴州省科學(xué)技術(shù)廳科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目（No.黔科合J字LKA[2012]05號(hào)、黔科合J字LKA[2013]06、黔教科合KY字[2013] 178號(hào)）

龍菊（1983—），女（苗），副教授，碩士研究生，研究方向：食品微生物。