改進MSPD-HPLC法快速檢測豬血豆腐中鎮(zhèn)靜劑及雌激素殘留

羅慧玉，徐鵬，*，閆偉偉，陳建華

（1.張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口075000；2.宣化鋼鐵公司職工醫(yī)院，河北張家口075100）

改進MSPD-HPLC法快速檢測豬血豆腐中鎮(zhèn)靜劑及雌激素殘留

羅慧玉1，徐鵬1，*，閆偉偉1，陳建華2

（1.張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口075000；2.宣化鋼鐵公司職工醫(yī)院，河北張家口075100）

建立改進了的基質(zhì)固相分散萃取（MSPD）-高效液相色譜法（HPLC/UVD）同時快速檢測豬血豆腐中的4種鎮(zhèn)靜劑（艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮和地西泮）及己烯雌酚殘留的方法。樣品以無水硫酸鈉和弗洛里西土（質(zhì)量比4∶1）為分散劑和凈化劑，甲醇為溶劑。色譜條件：C18色譜柱（5μm，250mm×4.6mm i.d.），甲醇-乙腈-水（體積比30∶30∶40）為流動相，流速：1.0mL/min，檢測波長235 nm，柱溫：30℃。5組分在0.010μg/mL～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不低于0.999 2。豬血豆腐中4種鎮(zhèn)靜劑的方法檢出限均為10 ng/g，己烯雌酚的方法檢出限為15 ng/g；5組分平均回收率在82.4%～104.5%之間，相對標準偏差為1.7%～3.5%。結(jié)果表明該方法簡便、快速、經(jīng)濟，適用于豬血豆腐中己烯雌酚及多種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的快速檢測。

基質(zhì)固相分散萃取；高效液相色譜法；豬血豆腐；鎮(zhèn)靜劑；雌激素

鎮(zhèn)靜劑類藥物（Sedatives）對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的抑制作用，可以減輕或消除動物狂躁不安，該類藥物除具有鎮(zhèn)靜作為外，很多還是生長促進劑，具有使動物嗜睡少動，生長快速、改變?nèi)赓|(zhì)的作用。另外，在動物運輸過程中使用該類藥物，可減少動物體重下降和死亡，還可防止動物肉的品質(zhì)降低。近年來，一些不法商販在動物飼養(yǎng)和運輸過程中擅自非法添加使用這些藥物，使其原形和代謝產(chǎn)物不可避免的殘留于動物源食品中，造成食品安全隱患，進而對人體健康造成不良影響。己烯雌酚是一種人工合成非甾體類雌激素，能夠促進家畜的生長，長期食用含己烯雌酚的食品易致兒童性早熟、男性生殖系統(tǒng)異常，女性易發(fā)生乳腺癌等[1]。我國農(nóng)業(yè)部第176號公告規(guī)定嚴禁在動物飼料和飲用水中使用這兩類藥物，在動物源食品中不得檢出。

目前，檢測鎮(zhèn)靜劑類藥物的方法有：液相色譜法（HPLC）[2]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/ MS）[3-4]，氣相色譜/質(zhì)譜法（GC/MS）[5]等。檢測雌激素類藥物的方法有：高效液相色譜法測定（HPLC）[6]，氣相色譜法[7]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[8]，酶聯(lián)免疫檢測法[9]等。HPLC-MS/MS和GC-MS方法具有準確性好、靈敏度高等優(yōu)點，但儀器價格昂貴，普及范圍受到限制。

基質(zhì)固相分散萃取（MSPD）是由Barker等[10]首次提出的一種樣品處理技術(shù)。MSPD法是將常規(guī)的固相分散技術(shù)與反向鍵合填料相結(jié)合，使得組織勻漿、提取和凈化能夠在同一操作中完成。我們對該方法做了進一步的優(yōu)化和改進，省略了溶解、裝填柱子、洗脫等步驟，處理步驟大為減少、方法操作更為簡化，結(jié)合高效液相色譜，對豬血豆腐中4種鎮(zhèn)靜劑艾司唑侖、阿普唑侖、地西泮、氯氮及雌激素己烯雌酚進行了快速分析測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC 2010A HT高效液相色譜儀、LC-2010HT紫外檢測器、SPD-M10A VP二極管陣列檢測器：島津公司；LC-Solution色譜工作站；YF-103型粉碎機：瑞安市永歷制藥機械有限公司；XH-D渦旋混合器：江蘇天翎儀器有限公司；800型電動離心機：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；KL512J型水浴氮吹儀：北京康林科技有限責任公司；Milli-Q Integral純水/超純水機：美國Millipore公司。

艾司唑侖（批號：1219-0102）、阿普唑侖（批號：171218-200603）、氯氮（批號：171248-200301）、地西泮（批號：171225-200302）、己烯雌酚（批號：100033-200607，含量：99.9%）：購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純；所用水為超純水；其余試劑均為分析純；豬血豆腐：購自超市。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的制備

1.2.2 色譜條件

色譜柱：YMCC18柱（5μm，250mm×4.6mm i.d.）；柱溫：30℃；流動相∶甲醇-乙腈-水（30∶30∶40）；流速：1.0mL/min；檢測波長：235 nm；進樣量：10μL。

1.2.3 樣品處理

稱取勻漿好的豬血豆腐樣品1.0 g于研缽中，加入4.0 g混合分散劑[無水硫酸鈉∶弗洛里西土（質(zhì)量比4∶1）]，充分研磨至表面無殘余水分；將研磨好的樣品轉(zhuǎn)移至具塞三角瓶中，加入10mL甲醇，渦旋震蕩1min，離心，取上清液；殘渣移入上述具塞三角瓶中，再用6mL甲醇分兩次加入到三角瓶中同法進行萃取（每次3mL）；將3次萃取所得上清液合并后用氮吹濃縮至5.0mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后取10μL進樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本試驗采用甲醇-乙腈-水作為流動相，考察了不同體積比對各組分的保留時間和分離情況，結(jié)果表明甲醇-乙腈-水體積比為30∶30∶40時，艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、己烯雌酚、地西泮5組分能完全分開，峰型較好，保留時間相對較短。因此本試驗采用體積比為30∶30∶40的甲醇-乙腈-水體系作為流動相。標準物譜圖見圖1。

圖1 標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard solution

2.2 分散劑種類及用量的選擇

在基質(zhì)固相分散樣品處理方法中，分散劑多為各類吸附劑，如硅膠、氧化鋁、弗洛里西土等，試驗考察了不同的分散劑。當分散劑全部為弗洛里西土時，樣品水分殘留過多，我們提出向分散劑中加入無水硫酸鈉，無水硫酸鈉能夠很好地吸收樣品中的水分，同時破壞樣品組織。試驗考察了不同比例的無水硫酸鈉與弗洛里西土混合分散劑對試驗效果的影響，當無水硫酸鈉與弗洛里西土（質(zhì)量比4∶1）作為分散劑時，既能很好的吸附樣品中的水分，同時又能對樣品有一定的凈化作用。試驗考察了混合分散劑用量為1.0 g～6.0 g時對試驗效果的影響。經(jīng)比較當樣品與混合分散劑為1∶3以下時，基質(zhì)干擾嚴重，當所加混合分散劑為4.0 g時，豬血豆腐中的水分被完全吸收、分散效果良好且樣品得到很好的凈化。如圖2所示。

圖2 樣品與分散劑比例對萃取效果的影響Fig.2 The influence of the samples and dispersant quality ratio over the extraction effect

2.3 萃取劑用量的選擇

5種待測物在甲醇中溶解性良好，且只作為極性溶劑的甲醇不易把樣品中的非極性干擾物萃取出來，故選用甲醇作萃取劑。萃取劑體積對萃取效果的影響如圖3所示。

圖3 萃取劑體積對萃取效果的影響Fig.3 The influence of extractant volume over the extraction effect

考察了不同萃取劑體積對試驗效果的影響，樣品為1.0 g時，萃取體積在10mL～18mL，隨著溶劑體積加大，各組分峰面積值增大，當萃取體積超過16mL時，各組分峰面積值趨于平緩或下降，故選擇16mL為最佳萃取體積。

2.4 萃取次數(shù)的選擇

在萃取劑體積相同的條件下，萃取次數(shù)會直接影響樣品回收率。萃取次數(shù)對萃取效果的影響如表1所示。

表1 萃取次數(shù)對萃取效果的影響Table1 The influence of extractant times over the extraction effect

試驗同時考察了萃取劑總體積為16mL時，不同萃取次數(shù)對萃取效果的影響，結(jié)果顯示當萃取次數(shù)為3次時，各組分回收率達到82.4%～104.4%。

2.5 線性方程、檢出限和定量限

各成分線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

表2 線性方程和檢出限Table2 Linearity and detection limits

移取儲備液逐級稀釋，配成一系列濃度的混合工作溶液，在所選的色譜條件下，以峰面積對質(zhì)量濃度繪制工作曲線，5種化合物在0.010μg/mL～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不低于0.999 2。

在樣品測定的色譜條件下，以3倍信噪比確定各成分的最低檢出限：艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、地西泮為0.01μg/g，己烯雌酚為0.015μg/g；以10倍信噪比確定各成分的定量限：艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、地西泮為0.033μg/g，己烯雌酚為0.05μg/g。

2.6 加標回收率和精密度

取1.0 g市售豬血豆腐6份，按1μg/g的加標水平，加入一定量標準混合溶液，按2.1～2.4優(yōu)化后的方法處理樣品。在最優(yōu)化的色譜條件下平行測定，樣品加標色譜圖見圖4，根據(jù)樣品液的本底值和加標值，計算相應的回收率，如表3所示。

圖4 加標樣品色譜圖Fig.4 THE chromatograms of add sample

表3 樣品加標回收率與精密度（n=6）Table3 The recoveries and precision（n=6）

由表3可知，5種化合物平均回收率在82.4%～104.4%之間，RSD為1.7%～3.5%（n=6），結(jié)果表明該方法具有較高準確度及精密度。

2.7 樣品測定

采用本文建立的方法，對隨機購買的3份市售豬血豆腐用最優(yōu)的樣品前處理方法進行處理，并在最優(yōu)的色譜條件下重復測定每個樣品3次。5種待測物質(zhì)均未被檢出。樣品色譜圖見圖5。

3 結(jié)論

圖5 實際樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of the real sample

采用改進了的MSPD法對豬血豆腐中的4種鎮(zhèn)靜劑（艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、地西泮）及己烯雌酚殘留進行樣品前處理，該方法與傳統(tǒng)基質(zhì)固相分散萃取方法相比，省去了裝填柱子的過程，儀器設(shè)備簡單經(jīng)濟，同時采用混合分散劑不僅對樣品進行了凈化同時也可吸收了樣品中的水分；該方法省時快速，步驟操作簡單，有機溶劑使用量少；提取凈化效率高、回收率、精密度較好，并結(jié)合采用高效液相色譜-紫外檢測器檢測，完全滿足了試驗靈敏度要求，可對豬血豆腐樣品中的艾司唑侖、阿普唑侖、氯氮、地西泮及己烯雌酚殘留同時進行快速檢測。

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Determination of Estrogen and Sedatives in Pig Blood Tofu Using Modified MSPD-HPLC Spectrometry

LUO Hui-yu1，XU Peng1，*，YAN Wei-wei1，CHEN Jian-hua2
（1.Zhangjiakou Food and Drug Inspection Center，Zhangjiakou 075000，Hebei，China；2.Xuanhua Iron and Steel Company Worker Hospital，Xuanhua075100，Zhangjiakou，China）

A method was established for the separation and determination of diethylstilbestrol and four sedatives（estazolam，alprazolam，chlordiazepoxide and diazepam）in pig blood tofu by modified solid-phase dispersive extraction with high performance liquid chromatography.The anhydrous sodium sulfate and florisil（the ratio of quality 4∶1）was the dispersing agent and clean-up reagent in the process of modified solid-phase dispersive extraction.The methanol was chose as the solvent.The estrogen and sedatives were separated on C18column（5μm，250mm×4.6mm i.d.）employing methanol∶acetonitrile∶water=30∶30∶40 as mobile phase and determined using UV detector at 235 nm.The column temperature was 30℃.The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min.The linearity was good in the range of 0.010μg/mL-10μg/mL with the correlation coefficients above than 0.999 2.The limit of detection of sedatives was 10 ng/g and the limit of detection of diethylstilbestrol was15 ng/g The average recoveries of estrogen were 82.4%to 104.5%.The relative standard deviations were 1.7%-3.5%.The method is simple，quick and inexpensive，which was available for the detection of diethylstilbestrol and sedatives in pig blood tofu.

MSPD；HPLC；pig blood tofu；narcotic；estrogen

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.032

2016-04-19

羅慧玉（1984—），女（漢），主管藥師，大學本科，主要從事食品安全檢測。

*通信作者：徐鵬，男，主管藥師，碩士，主要從事食品安全檢測。