QuEChERS結合柱凈化的超高效液相色譜-串聯質譜法測定有機肥中46種抗生素

汪建妹，劉艷平，陳 靜，吳慧珍，夏 魏，李祖光，錢鳴蓉*

(1.浙江省農業(yè)科學院農產品質量標準研究所，浙江省植物有害生物防控重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2.浙江工業(yè)大學 化工學院，浙江 杭州 310014；3.浙江醫(yī)藥股份有限公司，浙江 紹興 312000)

QuEChERS結合柱凈化的超高效液相色譜-串聯質譜法測定有機肥中46種抗生素

汪建妹1，劉艷平2，陳 靜3，吳慧珍2，夏 魏2，李祖光2，錢鳴蓉1*

(1.浙江省農業(yè)科學院農產品質量標準研究所，浙江省植物有害生物防控重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2.浙江工業(yè)大學 化工學院，浙江 杭州 310014；3.浙江醫(yī)藥股份有限公司，浙江 紹興 312000)

建立了超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)同時測定有機肥中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內酯類46種抗生素的分析方法。樣品用乙腈-EDTA緩沖溶液(pH 10.0)提取，鹽析后離心分層，乙腈層按QuEChERS法，采用吸附劑凈化；緩沖溶液層經HLB柱凈化。ACQUITY UPLC BEH C18柱用作色譜分離，以2 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇為流動相進行梯度洗脫；電噴霧電離源正離子(ESI+)多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測，基質外標法定量。46種抗生素在1～200 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r2)為0.996 6～0.999 9。在25，100，400 μg/kg加標濃度下，3類抗生素的回收率分別為67.8%～95.6%，65.6%～89.4%和66.6%～107.8%，相對標準偏差為0.4%～11.9%；方法檢出限(S/N=3)為0.6～4.6 μg/kg，定量下限(S/N=10)為2.1～15.4 μg/kg。

超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)；抗生素殘留；有機肥；QuEChERS結合柱凈化

大量研究表明，養(yǎng)殖場排出的動物糞便、污水和周邊土壤中含有多種抗生素殘留[1-6]，畜禽糞便經發(fā)酵加工后可作為有機肥施于農田，雖然部分抗生素在加工過程中發(fā)生吸附與降解，但商品有機肥中仍存在多種抗生素殘留，對生態(tài)環(huán)境具有潛在危害[3-6]。因此，建立有效檢測有機肥中抗生素的方法對于提高有機肥的質量和維護生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義。

已報道的有機肥中抗生素檢測方法主要通過機械振動或超聲協助提取后，用HLB柱[4,7-9]或SAX-HLB串聯柱凈化[10-12]，然后以液相色譜-紫外法[4,10-11]或液相色譜-串聯質譜法[7-9,12]測定。其中，Hu等[4]采用HLB單柱凈化，高效液相色譜-紫外法測定有機肥中13種抗生素，需采用2種不同流動相分離待測物，導致部分抗生素的回收率低于60%；葛峰等[12]采用SAX-HLB串聯柱進行富集與凈化，超高效液相色譜-串聯質譜法測定有機肥中18種抗生素，其過程相對繁瑣、耗時較長。QuEChERS(Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)方法是集萃取和凈化為一體的新型樣品前處理方法，在食品檢測中得到了廣泛應用[13-14]，但在有機肥中抗生素多殘留檢測方面的應用未見報道。

本文針對目前畜禽業(yè)常用的磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內酯類46種抗生素，采用QuEChERS結合柱凈化的前處理手段進行富集與凈化，UPLC-MS/MS進行測定，建立了一種靈敏、高效同時測定商品有機肥中多種抗生素殘留的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAPTM6500三重四極桿-線性離子阱復合質譜系統(美國AB Sciex公司)；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，i.d.，1.7 μm，Waters公司)；Sorvall Primo R高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg，Waters公司，使用前分別以10 mL甲醇、10 mL去離子水活化)。甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；NaCl、無水Na2SO4、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)(分析純)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18購自Agela公司。

18種磺胺類、19種喹諾酮類、9種大環(huán)內酯類藥物購自Dr.Ehrenstorfer公司，純度均高于97%。藥物名稱及縮寫見表1。

1.2 標準溶液配制

以甲醇為溶劑分別配制標準儲備液(20.0 mg/L)，于-18 ℃保存。臨用時以甲醇稀釋上述標準儲備液，配制成所需濃度的標準工作液。

1.3 樣品采集

樣品為市售商品有機肥，于每種有機肥包裝袋內5個不同位置采樣，混勻后按照四分法取0.5 kg作為供試樣品，風干粉碎后過1 mm篩，待用。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取 稱取1.0 g有機肥于50 mL離心管中，加入10 mL EDTA(pH 10.0)緩沖溶液，渦旋1 min，靜置15 min后加入10 mL乙腈，渦旋1 min，7 000 r/min離心5 min，轉移上清液于另一離心管中，加入4 g NaCl，渦旋15 s，再次離心5 min后分層，上層為乙腈層，下層為緩沖溶液層。

1.4.2 多級凈化 取7 mL乙腈層于15 mL離心管中，加入350 mg PSA和700 mg C18，渦旋1 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于10 mL試管中，氮吹近干，待接收緩沖溶液層經固相萃取凈化后的洗脫液。

取5 mL緩沖溶液層，用鹽酸調節(jié)pH值至4.0，轉移至活化后的HLB柱。待上樣完畢后用10 mL水淋洗，7.5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于上述吹干的試管中，氮吹近干，以1 mL甲醇-水(50∶50)定容，混勻，過0.22 μm濾膜，上機檢測。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，柱溫：40 ℃，進樣體積：5.0 μL，流動相：A為2 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，B為甲醇，流速：0.20 mL/min，梯度洗脫程序：0～3 min，5%～20% B；3～10 min，20%～30% B；10～16 min，30%～90% B，保持2 min；18～18.5 min，90%～10% B；18.5～19.5 min，10%～5% B，保持5.5 min。

1.5.2 質譜條件 離子源：電噴霧電離ESI(+)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；輔助氣：40 psi；46種藥物的多反應監(jiān)測(MRM)參數見表1。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

參考QuEChERs法(方法1)進行有機肥中抗生素的加標回收實驗。1.0 g樣品經10 mL EDTA緩沖溶液(pH 4.0)、10 mL乙腈超聲提取15 min后，加入4 g NaCl，7 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液，加入500 mg無水Na2SO4,50 mg PSA和100 mg C18凈化并再次離心，取0.5 mL上清液，用去離子水定容至1 mL后過膜檢測。基質外標法定量，結果如圖1～3所示，磺胺類抗生素中，STZ和SML的回收率低于40%，另有8種磺胺類抗生素的回收率為40%～60%；大環(huán)內酯類中，CLI，TYL和KIT的回收率為41.5%～56.5%，LIN的回收率僅13.4%；喹諾酮類抗生素的提取效果普遍較差，僅有3種的回收率高于60%。隨后改變緩沖溶液pH值(pH=7.0和10.0)，結果發(fā)現pH值的變化對乙腈相提取抗生素的效果影響較小。

圖1 4種提取方法中18種磺胺類抗生素處于不同回收率范圍內的數量Fig.1 Number of 18 sulfonamides located in different recovery ranges with four extraction methods

圖2 4種提取方法中19種喹諾酮類抗生素處于不同回收率范圍內的數量Fig.2 Number of 19 quinolones located in different recovery ranges with four extraction methods

圖3 4種提取方法中9種大環(huán)內酯類抗生素處于不同回收率范圍內的數量Fig.3 Number of 9 macrolides located in different recovery ranges with four extraction methods

由于部分抗生素易溶于水相，難以轉移至乙腈相，故在方法2中對提取的上下兩相分別進行凈化。有機相采用吸附劑凈化；水相經HLB柱凈化，并以凈化后的有機相作為洗脫液。收集洗脫液，氮吹近干，復溶過膜后檢測。結果如圖1～3，該改進步驟(方法2)可提高部分喹諾酮類抗生素的回收率，但仍有3種抗生素的回收率低于20%，9種抗生素的回收率為20%～40%，4種抗生素的回收率為40%～60%；大環(huán)內酯類中，TYL和KIT的回收率略低于40%；部分磺胺類的回收率略有降低，回收率在60%～100%范圍內的抗生素數量降至4種，STZ，SPD，SMX，SML的回收率低于40%，故仍需優(yōu)化。

在方法3中，有機相凈化后直接轉移至試管中氮吹近干，采用5%氨化甲醇作為HLB柱洗脫液[15-16]，并以上述含有機相的試管收集洗脫液，氮吹近干，復溶過膜后檢測。結果表明，磺胺類抗生素中僅有3種的回收率低于60%(SDZ，STZ，SML)；9種大環(huán)內酯類的回收率均高于40%，且有5種的回收率為80%～110%；喹諾酮類抗生素的回收率普遍提高，較方法1和2均有明顯改善。

pH值可能會影響緩沖溶液提取有機肥中抗生素的效率，因此在方法3的基礎上，考察了3種pH值(pH=4.0，7.0，10.0)EDTA緩沖溶液對回收率的影響。當pH值為10.0時，磺胺類抗生素的回收率為68.4%～90.5%，喹諾酮類為65.8%～89.6%，大環(huán)內酯類為66.3%～107.8%，明顯高于其他pH值緩沖溶液的提取效率(方法4)，結果見圖1～3。高pH值的緩沖溶液能破壞藥物在有機肥表面的氫鍵等吸附作用[17-18]，有利于化合物與基質的解離。因此本實驗最終采用方法4作為樣品前處理方法。

2.2 基質效應

將空白有機肥樣品按“1.4”方法進行處理，分別配制50，100，200 μg/L 3個濃度水平的基質加標溶液和純溶劑加標溶液，在優(yōu)化前處理條件下，當平均基質效應(增強或抑制)超過20%，則認為基質效應對定量檢測具有顯著影響。基質效應(ME)通過下式計算:ME(%)=(A2-A1)/A1×100%。式中，A1為特定濃度下的抗生素在純溶劑中的平均峰面積；A2為相同濃度下的抗生素在空白有機肥萃取液中的平均峰面積。采用改進的前處理方法處理有機肥樣品并檢測，結果顯示6種抗生素(PIP，NOR，CIP，CIN，SPA，ERY)的基質增強或抑制效應略大于20%，因此采用基質匹配校正曲線定量，以減少基質干擾對結果的影響。

2.3 方法的線性關系

在優(yōu)化的色譜-質譜條件下，46種抗生素混合標準溶液可獲得較好地分離。選用空白有機肥樣品按“1.4”方法處理，配制質量濃度分別為1.0，5.0，10.0，50，100，200 μg/L的基質標準溶液，以質量濃度(x,μg/L)為橫坐標，定量離子色譜峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。46種抗生素的基質匹配校正曲線在1.0～200 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r2)為0.996 6～0.999 9。圖4為陽性豬糞源有機肥樣品中4種檢出抗生素的定量離子色譜圖。

2.4 方法的回收率、精密度與檢出限

選用空白有機肥樣品，按所建立的方法處理，分別在25，100，400 μg/kg水平下進行加標回收實驗，每個水平重復測定6次，磺胺類抗生素的平均回收率為67.8%～95.6%，相對標準偏差(RSD)為0.4%～7.6%；喹諾酮類的平均回收率為65.6%～89.4%，RSD為0.7%～10.9%；大環(huán)內酯類的平均回收率為66.6%～107.8%，RSD為1.5%～11.9%(表1)。在25 μg/kg加標回收實驗條件下，根據3倍信噪比(S/N=3)確定46種抗生素的檢出限(LOD)為0.6～4.6 μg/kg，S/N=10確定定量下限(LOQ)為2.1～15.4 μg/kg(見表1)。

表1 46種抗生素的保留時間、質譜參數、方法檢出限、定量下限、回收率與相對標準偏差Table 1 Retention times,MS parameters,LODs,LOQs,recoveries and RSDs of 46 antibiotics

*quantitative ion

2.5 實際樣品的分析

應用本方法測定了20份有機肥樣品(10份豬糞源，10份雞糞源)，對檢出濃度超出線性范圍的樣品進行逐步稀釋，結果檢出SDZ，SM2，OFL，CIP，NOR，ENR和TIL，檢出率分別為5%，30%，50%，15%，15%，65%和5%，檢出含量分別為30.5 μg/kg，31.9～232.7 μg/kg，20.3～262.8 μg/kg，18.2～33.4 μg/kg，57～80.7 μg/kg，15.2～678.6 μg/kg和11 μg/kg。

3 結 論

本文建立了QuEChERS結合柱凈化前處理手段，同時測定有機肥中46種抗生素的UPLC-MS/MS法，并成功應用于實際樣品的分析。本方法操作簡單、靈敏度強、回收率較高、穩(wěn)定性好，能同時測定多種抗生素殘留，可作為有機肥中獸藥抗生素多殘留痕量檢測的方法。

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Determination of 46 Antibiotics Residues in Organic Fertilizer by UPLC-MS/MS with QuEChERS Combined with Column Purification

WANG Jian-mei1，LIU Yan-ping2，CHEN Jing3，WU Hui-zhen2，XIA Wei2，LI Zu-guang2,QIAN Ming-rong1*

(1.State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable，Pest and Disease Control，Institute of Quality and Standard for Agro-products，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China；2.College of Chemical Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；3.Zhejiang Medicine Co.，Ltd.，Shaoxing 312000,China)

A confirmative method was developed for the simultaneous determination of 46 antibiotics,including sulfonamides，quinolones and macrolides in organic fertilizer by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(UPLC-MS/MS).The samples were extracted with acetonitrile-EDTA buffer solution(pH 10.0),and separated by centrifugation after salting-out.The upper acetonitrile layer was purified by the QuEChERS steps with sorbents.The buffer solution layer was purified with solid-phase extraction cartridge.The separation of target drugs was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18column using a mobile phase consisting of 2 mmol/L ammonium acetate with 0.1% formic acid and methanol by gradient elution．The analysis of target compounds was carried out with positive electrospray ionization(ESI+)source under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The matrix-matched external standard calibration was used for quantification.Good linearities for the 46 antibiotics were achieved over the concentration of 1-200 μg/L,with correlation coefficients(r2) of 0.996 6-0.999 9.The recoveries of sulfonamides,quinolones and macrolides at spiked levels of 25，100,400 μg/kg were in the range of 67.8%-95.6%,65.6%-89.4% and 66.6%-107.8%,respectively,with relative standard deviations(RSDs) of 0.4%-11.9%.The limits of detection(LOD,S/N=3) were 0.6-4.6 μg/kg,and the limits of quantitation(LOQ,S/N=10) were 2.1-15.4 μg/kg.

ultrahigh performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(UPLC-MS/MS)；antibiotics residues；organic fertilizer；QuEChERS combined with column purification

2016-08-04；

2016-10-24

農業(yè)部公益性行業(yè)專項(201303091)；浙江省自然科學基金(LY14B070008)；省部共建國家重點實驗室培育基地項目(2010DS700124-ZZ1602);浙江省農業(yè)科學院中美三方合作項目(2010DS700124-ZM1604)；寧波科技項目(2013C11024)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.011

O657.63;O629.5

A

1004-4957(2017)02-0218-06

*通訊作者：錢鳴蓉，副研究員，研究方向：農產品質量安全，Tel：0571-86404015，E-mail：qian_mingrong123@163.com