魚組織中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量的超高效液相色譜法測定

劉永濤，李 樂，王賽賽，余琳雪，楊秋紅，楊移斌，艾曉輝*

(1.中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223；2.淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430223；3.中國水產科學研究院，北京 100141；4.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306)

魚組織中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量的超高效液相色譜法測定

劉永濤1,2，李 樂3，王賽賽4，余琳雪4，楊秋紅1，楊移斌1,2，艾曉輝1,2*

(1.中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223；2.淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430223；3.中國水產科學研究院，北京 100141；4.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306)

建立了黃顙魚、團頭魴和草魚血漿、肌肉、肝臟、腎臟中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素同時測定的超高效液相色譜紫外檢測法(UPLC-UV)。樣品經乙腈(含0.01%乙酸)提取，無水硫酸鈉除水，正己烷去脂等樣品處理，在ACQUIT UPLC BEH C18色譜柱上分離，428 nm波長處測定。雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素在0.01～5.00 mg/L濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r2)分別為0.998 7，0.999 8和0.999 6。在空白魚組織中進行0.025，0.05，0.50，1.00 mg/kg 4個水平的加標回收實驗，3種待測組分的平均回收率為64.7% ～ 102.2%，相對標準偏差為0.69% ～ 10.8%。魚組織中3種待測組分的檢出限(LOD)均為0.010 mg/kg，定量下限(LOQ)均為0.025 mg/kg。應用該方法研究了姜黃素在團頭魴體內的藥代動力學規律。

魚組織；雙去甲氧基姜黃素；去甲氧基姜黃素；姜黃素；超高效液相色譜

姜黃素類化合物主要包括雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素[1]，其中姜黃素約占70%，去甲氧基姜黃素約占15%，雙去甲氧基姜黃素約占10%。姜黃素在提高魚類消化酶活性，促進魚類生長，增強魚體免疫功能及改善肌肉品質和色澤等方面具有一定作用[1]。研究表明，飼料中添加姜黃素可以顯著提高草魚腸道中蛋白酶和淀粉酶的活性，促進魚體對營養物質的吸收[2]。王進波等[3]報道姜黃素不僅可以促進大黃魚(Pseudosdaenacrocea)的生長，還可促進大黃魚皮膚和肌肉的著色。姜黃素可以顯著提高虹鱒(Salmogairdneri)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)和羅非魚(Oreochromisspp)等魚體的抗氧化能力[4-5]。牛生洋等[6]報道了姜黃素添加到飼料中還能夠預防魚小瓜蟲病、腸炎病和赤皮病等疾病。鑒于姜黃素在水產動物體內表現出的優良藥理活性，其在水產養殖業中被廣泛應用，2014年我國農業部也批準姜黃素作為新飼料添加劑使用。

目前，尚未見魚組織中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量測定的方法。已報道的分析方法多是對姜黃提取物中姜黃素類化合物含量的測定，使用的儀器有熒光分光光度計[7]、高效液相色譜儀[8-12]、高效毛細管電泳儀[13]、高效液相色譜串聯質譜儀[14]。張盼盼等[15]和楊方等[16]分別采用高效液相色譜建立了食品和淀粉類食品中姜黃類化合物的分析方法，顧吉普等[17]采用高效液相色譜法測定了大鼠血漿中姜黃素的含量。由于姜黃素對水產動物生理和疾病預防方面的作用明顯，為更好地研究姜黃素在魚體內的藥理作用和組織分布情況，有必要對魚體組織中姜黃素類化合物含量進行分析。本文建立了黃顙魚、團頭魴和草魚體內組織中雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量的超高效液相色譜分析方法，優化了前處理和色譜條件，進行了方法學驗證，并將該方法用于姜黃素在團頭魴體內的藥動學研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜帶紫外(UV)檢測器(美國Waters公司)；Agilent 1260 高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器(DAD)；Mettler-TOLEDO AE-240電子天平(梅特勒-托利多公司)；HITACHI 20PR-520型自動高速冷凍離心機(日本日立公司)；FS-1高速勻漿機(華普達教學儀器有限公司)；HQ-60-Ⅱ旋渦混合器(北京北方同正生物技術發展有限公司)；HGC-12氮吹儀(HENGAO T&D公司)。

雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素標準品(純度≥98%，成都克洛瑪生物科技有限公司)；姜黃素標準品(純度≥98.9%，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈、乙酸、乙酸乙酯、正己烷(色譜純，美國J.T.Baker公司)；Milli-Q Advantage A10超純水機。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取0.1 g(精確至0.001 g)雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素對照品，用乙腈溶解并定容至100 mL，分別配制成1.0 mg/mL標準儲備液，于-20 ℃冰箱中冷藏保存。分別移取5 mL 3種姜黃素類化合物的標準儲備液置于同一100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋配制成混合標準中間液。

1.3 標準工作曲線的制備

用流動相稀釋混合標準中間液，得到雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的質量濃度均為0.01，0.05，0.20，1.00，5.00 mg/L的標準工作溶液，以質量濃度(x，mg/L)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算回歸方程和相關系數。

1.4 樣品前處理

1.4.1 血漿樣品 移取1 mL血漿樣品于10 mL離心管中，加入4 mL提取液，渦旋30 s，再加入0.5 g無水硫酸鈉，渦旋30 s，7 000 r/min離心5 min，轉移提取液至另一10 mL離心管中，重復提取1次，合并提取液，置于45 ℃氮吹儀上氮吹至干，用1 mL流動相溶解殘渣，過0.22 μm濾頭，上UPLC分析。

1.4.2 肌肉樣品 稱取2 g 肌肉樣品于15 mL離心管中，加入5 mL提取液，渦旋30 s，再加入1 g 無水硫酸鈉，渦旋30 s，7 000 r/min離心5 min，轉移提取液至另一10 mL離心管中，重復提取1次，合并提取液，置45 ℃氮吹儀上氮吹至干，用1 mL流動相溶解殘渣，再加入0.5 mL正己烷，渦旋30 s，8 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷層，下層過0.22 μm濾頭，上UPLC分析。

1.4.3 肝臟和腎臟樣品 準確稱取1 g 肝臟或腎臟樣品，分別置于10 mL離心管中，加入5 mL提取液，渦旋30 s，再加入0.5 g無水硫酸鈉，渦旋30 s，7 000 r/min離心5 min，將提取液轉移至另一10 mL離心管中，重復提取1次，合并提取液，置45 ℃氮吹儀上氮吹至干，用1 mL流動相溶解殘渣，再加入0.5 mL正己烷，渦旋30 s，8 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷層，下層過0.22 μm濾頭，上UPLC分析。

1.5 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)反相色譜柱；柱溫為30 ℃；流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL。流動相為乙腈-0.1%乙酸水溶液(體積比45∶55)，等度洗脫；紫外檢測波長為428 nm。

2 結果與討論

2.1 提取劑的選擇

根據姜黃素類化合物的理化特性，本實驗分別考察了乙酸乙酯、乙腈、乙醇、乙酸乙酯(含0.1%乙酸)、乙腈(含0.1%乙酸)、乙醇(含0.1%乙酸)、乙酸乙酯(含0.01%乙酸)、乙腈(含0.01%乙酸)、乙醇(含0.01%乙酸)作為提取溶劑時對魚組織中姜黃素類化合物的提取效果。在團頭魴肌肉中添加0.5 mg/kg的3種姜黃素類化合物標準品，做3個平行，計算其回收率，結果發現采用乙腈(含0.01%乙酸)作為提取劑時3種姜黃素類化合物的回收率最高，因此，最終選擇乙腈(含0.01%乙酸)作為魚組織中3種姜黃素類化合物的提取溶劑。

2.2 最大吸收波長、定容溶液和稀釋溶液的選擇

對姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素標準溶液進行最大吸收波長掃描，結果分別為428，422，418 nm。相同濃度下雙去甲氧基姜黃素的響應度最高，姜黃素的響應度最低，綜合考慮最終選擇檢測波長為428 nm。實驗發現，當采用乙腈、乙腈(含0.1%乙酸)和乙腈-水(45∶55)作為標準樣品定容溶液和標準工作溶液稀釋液時3種姜黃素類化合物不能分離，當以流動相作為定容溶液和標準工作溶液稀釋液時，3種姜黃素類化合物能夠完全分離。

2.3 線性關系

將“1.3”制備的標準工作溶液進樣分析，以雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的質量濃度(x,mg/L)為橫坐標，對應峰面積(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線。結果表明，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素均在0.01～5.00 mg/L濃度范圍內呈線性相關，回歸方程分別為y=143 789x-7 286.9，y=117 103x-3 441.5和y=109 407x-2 597.1，相關系數分別為0.998 7，0.999 8和0.999 6。

2.4 方法回收率、精密度、檢出限與定量下限

分別在黃顙魚、團頭魴和草魚的空白血漿、肌肉、肝臟和腎臟中添加濃度水平為0.025，0.05,0.50，1.00 mg/kg的雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素標準品，每個濃度水平6個平行樣品，按照“1.4”方法下進行樣品前處理，優化色譜條件下進行測定，得4個加標水平下的平均回收率分別為70.9%～99.6%，80.1%～102.2%，68.7%～81.4%，64.7%～ 86.3%；相對標準偏差(RSD)分別為0.69%～ 6.4%，2.0%～ 10.8%，1.6%～ 10.3%，4.2% ～9.2%。黃顙魚肌肉空白樣品及其加標樣品的色譜圖見圖1。3種姜黃素類化合物在魚組織中以大于3倍信噪比計算的檢出限(LOD)均為0.010 mg/kg，以大于10倍信噪比計算的定量下限(LOQ)均為0.025 mg/kg。

2.5 方法應用

采用本文建立的分析方法研究了姜黃素在團頭魴體內的藥代動力學規律，以100 mg/kg體重劑量口灌姜黃素混懸液(用乙醇溶解姜黃素后，加入可溶性淀粉用蒸餾水稀釋，配制成含1%可溶性淀粉，姜黃素為20 mg/mL的混懸液)，結果表明，姜黃素在團頭魴體內的最大峰濃度為(0.76±0.19) mg/kg，達峰時間為30 min。

3 結 論

本文建立了超高效液相色譜同時測定黃顙魚、團頭魴和草魚血漿、肌肉、肝臟和腎臟等組織中雙甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量的方法。本方法樣品前處理簡便快速、分離效果好，分析時間短，方法的線性范圍、加標回收率與精密度均能滿足魚組織中3種姜黃素類化合物含量的分析要求。方法的建立為姜黃素類化合物在魚體內藥動學和組織分布研究提供了技術保障。

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Simultaneous Determination of Bisdemethoxycurcumin，Demethoxycurcumin and Curcumin in Fish Tissues by UPLC

LIU Yong-tao1，2，LI Le3，Wang Sai-sai4，YU Lin-xue4，YANG Qiu-hong1，YANG Yi-bin1,2，AI Xiao-hui1，2*

(1.Yangtze River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuhan 430223，China；2.Hubei Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center，Wuhan 430223，China；3.Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141，China；4.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

An original method for the simultaneous determination of bisdemethoxycurcumin，demethoxycurcumin and curcumin in plasma，muscle，liver and kidney of yellow catfish(Pelteobagrusfulvidraco)，bluntnose black bream(Megalobramaamblycephala) and grass carp(Ctenopharyngodonidellus) was established by ultra high performance liquid chromatography with ultraviolet detection(UPLC-UV).The sample was extracted using acetonitrile containing 0.01% acetic acid，and the moisture of sample was removed with anhydrous sodium sulfate，thenn-hexane was used for removing fat in sample.After that，the sample prepared was separated on an ACQUIT UPLC BEH C18column and determined at 428 nm.Good linearities were observed in the range of 0.01-5.00 mg/L，and the correlation coefficients for bisdemethoxycurcumin，demethoxycurcumin and curcumin were 0.998 7，0.999 8 and 0.999 6，respectively.The average recoveries of 3 analytes in fish tissues at the spiked level of 0.025-1.00 mg/kg ranged from 64.7% to 102.2%,with relative standard deviations(RSDs) of 0.69%-10.8%.The detection limits(LODs) and quantitation limits(LOQs) for 3 analytes in fish tissues were all 0.010 mg/kg and 0.025 mg/kg，respectively.The presented method was firstly applied in the investigation on the pharmacokinetic profile of curcumin in bluntnose black bream.

fish tissues；bisdemethoxycurcumin；demethoxycurcumin；curcumin；ultra high performance liquid chromatography(UPLC)

2016-09-09；

2016-09-20

現代農業技術體系專項資金(CARS-49);中國水產科學研究院基本科研業務費資助(2016JBF0104)；公益性行業(農業)科研專項資助(201503108-CC-1)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.022

O657.72；S816

A

1004-4957(2017)02-0276-04

*通訊作者：艾曉輝，博士，研究員，研究方向：水產動物藥理，Tel：027-81780298，E-mail：liuyt@yfi.ac.cn