基質固相分散萃取-毛細管電泳測定米制品中丙烯酰胺

殷 斌，吳友誼，周震華，周靖雯

(蘇州科技大學 環境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009)

基質固相分散萃取-毛細管電泳測定米制品中丙烯酰胺

殷 斌，吳友誼*，周震華，周靖雯

(蘇州科技大學 環境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009)

建立了基質固相分散萃取-毛細管電泳法檢測米制品中丙烯酰胺的新方法。通過實驗確定了最佳前處理條件：C18及弗羅里硅土混合作為萃取分散劑(質量比1∶4)，樣品與分散劑的質量比為5∶9，洗脫液為丙酮-二氯甲烷(體積比6∶4)的混合溶劑，洗脫劑體積為10 mL。在優化實驗條件下，以20 mmol/L硼砂(pH 8.4)作緩沖溶液，在15 kV恒壓下進行分離，該方法的線性范圍為10～200 μg/mL，相關系數(r)為0.999 8，丙烯酰胺的檢出限為0.62 μg/mL，樣品中丙烯酰胺的回收率為85.7%～96.4%。

丙烯酰胺；基質固相分散；毛細管電泳；米制品

丙烯酰胺(Acrylamide)是一種神經毒素，威脅食品安全并對人類的健康產生嚴重危害，可導致細胞遺傳物質DNA的損傷[1]，高劑量的丙烯酰胺還會影響人類的神經系統[2]、生殖系統[3]并具有一定的致癌性[4]。食品加熱(包括油炸、烘焙、烹飪、蒸煮)過程往往產生丙烯酰胺，尤其是高溫處理的食品中廣泛存在較高水平的丙烯酰胺[5]，因而加熱食品中丙烯酰胺的分析對食品質量管理和保障食品安全具有重要的實際意義。米制品是我國居民日常生活的主要食物之一，但目前的研究集中于薯條、面包、咖啡等加熱食品，對米制品的研究較少。

目前，加熱食品中丙烯酰胺含量的檢測方法主要有GC-MS和LC-MS(包括LC-MS/MS)[6-13]，此外也有LC[14]，GC[15]和毛細管電泳(CE)分析丙烯酰胺的報道[16-18]。GC-MS和LC-MS測定結果較準確、檢出限較低、應用較廣泛，但儀器昂貴，往往需要衍生處理或加入同位素內標。LC 方法可不經衍生測定丙烯酰胺，操作相對簡單，但流動相的消耗較大且有毒。由于丙烯酰胺屬熱不穩定化合物，GC測定前需要衍生；而不經衍生GC直接測定雖分析時間較短，但檢出限偏高。毛細管電泳(CE)是20世紀80年代出現的分析技術，具有分離效率高、進樣量小、溶劑消耗少、分析時間短等優點，在丙烯酰胺檢測中有廣泛的應用前景。在樣品分析過程中，良好的樣品前處理方法不僅可以提高檢測的靈敏度、縮短檢測時間、提高檢測效率，還可以大幅去除雜質，降低基體水平。基質固相分散(MSPD)萃取技術整合了傳統樣品前處理技術中樣品勻化、提取、凈化等過程，集目標物提取、凈化和富集為一體，特別適用于處理固態、半固態樣品，而目前運用基質固相分散對米制品進行樣品前處理進而測定丙烯酰胺的研究尚未見報道。

本文針對丙烯酰胺現有分析方法中存在分析時間長、需加入內標等不足，通過基質固相分散萃取對樣品中的丙烯酰胺進行富集和凈化，建立了毛細管電泳檢測丙烯酰胺的新方法并將其應用于米類加熱食品的分析檢測，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ毛細管電泳儀(美國貝克曼公司)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)；固相萃取抽氣系統(美國Supelco公司)；DC12H 型氮吹儀(上海安普科學儀器公司)；SK-1快速混勻儀、KX-29離心沉淀機(金壇市科析儀器有限公司)；Master-S純水機(上海和泰儀器有限公司)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)丙烯酰胺標準品(純度>99%，阿拉丁公司)；甲醇、乙腈(色譜純，上海安普科學儀器公司)；丙酮、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷(分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司)；鐵氰化鉀(分析純，天津大茂化學試劑廠)；HC-C18填料、中性氧化鋁(分析純，450 ℃灼燒4 h)、弗羅里硅土(分析純)購自德國CNW科技公司；實驗室用水均為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 標準工作溶液的配制

儲備液的配制：稱取丙烯酰胺0.020 0 g于100 mL棕色容量瓶中，用水定容密封，-10 ℃下保存待用。各濃度的丙烯酰胺標準使用液由儲備液加水稀釋而成并經過0.22 μm 尼龍濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司)過濾。

準確稱取3.750 0 g鐵氰化鉀固體于25 mL棕色容量瓶中，用水定容配成Carrez Ⅰ溶液[19]。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集及前處理 雪餅、鍋巴、小小酥、長鼻王4種米制品購自校園周邊超市。樣品處理過程參照文獻[20]并加以改進：先用研缽將上述樣品磨碎，加入30 mL正己烷搖勻離心，去除上層溶液，置于烘箱中于40 ℃下烘干，待用。準確稱取3份各0.500 0 g樣品于研缽中，分別加入0.25 mL Carrez Ⅰ溶液，再分別稱取0.180 0 g C18以及0.720 0 g弗羅里硅土分散劑于3個研缽中，各研磨10 min至分散均勻，待裝柱。加標樣品與未加標樣品處理步驟相似，只是在“加入0.25 mL Carrez Ⅰ溶液”前需加入100 μL 200 μg/mL丙烯酰胺標準溶液并靜置15 min，使標液在樣品中更好的分散。

取3支10 mL玻璃注射器，在注射器底部裝少量脫脂棉并壓平，將研磨均勻的樣品分別轉移至注射器中，再于上方放少量脫脂棉，用力壓實。將柱子放于固相萃取裝置上，用洗脫液開始洗脫，洗脫速度控制在1滴/s，收集完洗脫液后，氮吹儀吹干，用0.4 mL水定容，再加入1 mL正己烷，混勻，去除少量的油類物質，3 000 r/min下離心10 min，取下層溶液，經0.22 μm濾膜過濾，濾液進樣，進行毛細管電泳分析。

1.3.2 電泳條件 熔融石英毛細管(河北銳灃色譜器件有限公司)：內徑50 μm，總長度50.3 cm，有效長度39.5 cm。為提高分析的重現性，每天進樣前，依次用0.1 mol/L NaOH、水、硼砂緩沖液沖洗毛細管8，5，6 min，進樣間分別用緩沖液沖洗2 min。毛細管電泳運行電壓：15 kV；0.5 psi壓力下進樣6 s；檢測波長：210 nm；溫度：25 ℃；緩沖溶液：20 mmol/L pH 8.4硼砂。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

緩沖液的選擇是影響毛細管電泳分離的主要因素，本文分別考察了硼砂和磷酸鹽對分離效果的影響，發現磷酸鹽的電流相對較大，基線不平穩，且分離效果欠佳。對于硼砂緩沖液，不同濃度的硼砂影響出峰的時間，濃度越大遷移時間越長，當采用20 mmol/L硼砂作為緩沖溶液時，出峰較快且基線平穩，因而采用20 mmol/L硼砂作為緩沖溶液。進一步考察了硼砂緩沖液pH值的影響，結果顯示，在8.2～10.2范圍內隨著pH值的增加，遷移時間增長，峰形變寬；當硼砂緩沖液的pH值為8.4時，丙烯酰胺出峰尖銳、無拖尾，且與雜質能較好的分離，因此選用pH 8.4的硼砂作為緩沖液。

研究了分離電壓在10～18 kV范圍內對各組分遷移時間的影響。結果發現，隨著電壓的升高，樣品的遷移速度加快，分析時間縮短，但焦耳熱相應增大，基線開始出現漂移，靈敏度降低。綜合考慮分離度、分析時間等因素，選擇15 kV 作為分離電壓。

在0.5 psi下，研究了進樣時間在2～12 s范圍內的影響，結果表明：隨著進樣時間的增加，峰高及峰寬均有所增加，當進樣時間超過6 s后，峰高變化較小，但峰展寬增大，本文最終選擇進樣時間為6 s。

考察了柱溫在15，20，25，30 ℃時對分離效果的影響，發現溫度對樣品的分離效果影響較小，但隨著溫度升高，出峰時間縮短，這是由于隨著溫度升高，緩沖液的粘度有所降低，從而使電滲流增大。但此時樣品中雜質峰與丙烯酰胺峰較接近，因此選擇最佳柱溫為25 ℃。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 分散劑的選擇 選用弗羅里硅土、C18、氧化鋁、活性炭作為備用分散劑，在未確定最佳洗脫劑時，考慮到丙烯酰胺的極性相對較大，先以8 mL乙腈為洗脫劑進行洗脫。按“1.3.1”方法加標處理雪餅樣品，每種分散劑對應的樣品平行制備3組，確定各分散劑的回收率。對比發現，弗羅里硅土比C18、氧化鋁及活性炭的吸附效果好，但回收率較低。考慮到弗羅里硅土的極性與丙烯酰胺的極性可能有所差異，可添加其他分散劑來調節極性，通過其他分散劑與弗羅里硅土混合比較發現，將弗羅里硅土與C18混合后作為分散劑的提取效果相對最好。

2.2.2 分散劑的比例選擇 稱取一定量的雪餅樣品并加標，考察相同量，但不同混合比例的C18與弗羅里硅土混合分散劑(1∶9，1∶6，1∶4，1∶3，1∶2)對加標回收率的影響。結果表明：當C18與弗羅里硅土的混合比例為1∶4時，回收率達到最大，繼續增大C18的量，回收率反而降低，因此實驗確定以C18∶弗羅里硅土(1∶4)作為分散劑。此外，由于所選樣品中含有少量蛋白質，而蛋白質易附著在毛細管內壁，從而影響檢測的準確性，本實驗采用加入適量CarrezⅠ溶液以抑制蛋白質的干擾。因此，最終以C18∶弗羅里硅土(1∶4)，同時加入0.25 mL CarrezⅠ溶液為分散劑。

圖1 分散劑對丙烯酰胺回收率的影響Fig.1 Effect of dispersant on recovery of acrylamide

2.2.3 樣品與混合分散劑比例的選擇 按“1.3.1”方法加標處理雪餅樣品5份，分別加入0.800 0，0.900 0，1.000 0，1.100 0和1.200 0 g 混合分散劑(C18∶弗羅里硅土=1∶4)，考察了樣品與分散劑比例對提取效果的影響。采用10 mL丙酮∶二氯甲烷(體積比6∶4)混合溶劑洗脫，進行基質固相提取。結果表明當分散劑的用量增至0.900 0 g時，回收率達到最大值，繼續增加分散劑的用量回收率反而減小(圖1)。因此采用樣品與分散劑的質量比為5∶9。2.2.4 洗脫劑及其用量的選擇 考察了甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯等作為洗脫劑對丙烯酰胺的洗脫能力。按“1.3.1”方法加標處理雪餅樣品，稱取1 g C18∶弗羅里硅土混合分散劑(1∶4)，洗脫液用量12 mL，進行基質固相分散萃取。結果表明，相比較其他幾種洗脫劑，丙酮對丙烯酰胺的洗脫效果較好，但洗脫出的雜質較多，而當丙酮與二氯甲烷混合洗脫時，對基質去除效果好，所得電泳圖雜質峰少，且回收率有所提高。進一步的實驗表明，當丙酮∶二氯甲烷的體積比為6∶4時，回收率最高且雜質較少，所以實驗最終選用丙酮∶二氯甲烷(6∶4)作為洗脫劑。 繼續考察了洗脫溶劑體積(6，8，10，12，14 mL)對丙烯酰胺回收率的影響，結果顯示，當洗脫劑從6 mL增至10 mL時，洗脫更加充分。繼續增加洗脫劑時，丙烯酰胺的回收率幾乎無變化，因此確定混合洗脫劑的體積為10 mL。

2.3 標準曲線與方法靈敏度

在最佳色譜條件下，以200 μg/mL丙烯酰胺儲備液配制濃度分別為10，20，40，80，100，200 μg/mL的系列標準溶液。經毛細管電泳儀測定，以丙烯酰胺所得峰面積(y)對其濃度(x，μg/mL)進行線性擬合。結果表明，在10～200 μg/mL范圍內，丙烯酰胺標準曲線的線性關系良好，回歸方程為y=208.4x+207.2，相關系數(r)為0.999 8。方法的檢出限(S/N=3)為0.62 μg/mL。

圖2 加標雪餅樣品(a)以及未加標長鼻王、小小酥、鍋巴、雪餅樣品的電泳圖(b～e)Fig.2 Electropherograms of spiked snow biscuit sample(a)，unspiked samples of Proboscis King biscuit(b)，fried cracker(c)，rice crust(d) and snow biscuit(e)

2.4 回收率實驗及實際樣品的檢測

在最優MSPD和分離條件下，利用所建立的方法測定了雪餅等米制品中的丙烯酰胺含量(圖2)。由圖可見，在優化條件下，電泳圖中丙烯酰胺的峰形尖銳對稱，雜質峰很少，表明分離效果好、基質去除較為徹底。分別在0.500 0 g雪餅樣品中，不加標和添加100 μL丙烯酰胺儲備液，制備平行樣各3份，測得雪餅中丙烯酰胺的平均含量為8.39 mg/kg，回收率為85.7%～96.4%，相對標準偏差(RSD)為1.5%。

將該方法用于所購其它樣品(鍋巴、長鼻王、小小酥)中丙烯酰胺含量的測定，分別測得丙烯酰胺含量為27.3，31.9，29.7 mg/kg。

3 結 論

本文將MSPD前處理技術與毛細管電泳技術相結合，建立了一種測定雪餅、鍋巴等米制食品中丙烯酰胺的新方法。結果表明，MSPD作為前處理方法能夠有效地提取米制品中的丙烯酰胺，具有良好的凈化作用。該方法操作簡便、靈敏度高、凈化效果好、回收率高，適用于米制品中痕量丙烯酰胺的測定。

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Determination of Acrylamide in Rice Product by Matrix Solid Phase Dispersion(MSPD)-Capillary Electrophoresis

YIN Bin，WU You-yi*，ZHOU Zhen-hua，ZHOU Jing-wen

(School of Environmental Science and Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009，China)

A new method coupling matrix solid phase dispersion(MSPD) with capillary electrophoresis was developed for the determination of acrylamide in rice product.The optimized conditions obtained in experiments were as follows：Florisil and C18were used as a mixed dispersant with a mass ratio of 1∶4.The mass ratio of sample to dispersant was 5∶9.The mixture of 10 mL acetone-dichloromethane(6∶4) was used as elution solvent.Under the optimized experimental conditions，20 mmol/L borate solution(pH 8.4) was used as buffer.The sample was separated at a constant voltage of 15 kV.The linear range of acrylamide was in the range of 10-200 μg/mL，with a correlation coefficient(r) of 0.999 8.The limit of detection(LOD，S/N=3) was 0.62 μg/mL for acrylamide and the recoveries were in the range of 85.7%-96.4%.

acrylamide；matrix solid-phase dispersion(MSPD)；capillary electrophoresis；rice product

2016-07-08；

2016-10-13

住建部科技計劃項目(2013-K7-24)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.023

O657.8；S852.44

A

1004-4957(2017)02-0280-04

*通訊作者：吳友誼，博士，副教授，研究方向：環境污染物分析，Tel：0512-68786836，E-mail：youyiwu@sohu.com