大白菜抗TuMV分子標記輔助選擇技術研

李巧云++張志剛++趙智中++劉栓桃++王立華++高會超++李溢真++徐文玲++劉賢嫻++劉辰

究

摘要：分別以大白菜TuMV國家級抗源材料8407和高感TuMV的核心種質材料冠291為親本構建分離群體，為驗證TuMV抗性基因TuRBCS01兩側緊密連鎖的分子標記mBr4055和BrID10723的檢測準確率，對上述兩個親本F2代分離群體的107個單株進行自交構建F2∶3家系，并對每個家系的TuMV抗性進行鑒定，以判斷原F2單株的TuMV抗性及基因型，同時利用上述兩個標記引物對F2代107個單株進行檢測，根據檢測結果及抗病性鑒定結果計算標記檢測的準確率。結果表明，兩標記均檢測為純合抗病的株系有22株，其中有2株經抗病性驗證為雜合抗病，其余均為純合抗病，檢測準確率為90.9%；兩標記均檢測為雜合抗病的有48株，經抗病性驗證，其中5株為純合抗病，5株為純合感病，其余均為雜合抗病，檢測準確率為79.2%；兩標記均檢測為純合感病的有23株，經抗病性驗證，其中4株為雜合抗病，1株為純合抗病，鑒定準確率為78.3%。上述檢測結果為更好地利用標記mBr4055和BrID10723進行分子標記輔助選擇奠定了基礎。

關鍵詞：大白菜；TuMV；抗性基因；分子標記應用

中圖分類號：S634.103.6文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）02-0010-05

大白菜是我國的重要蔬菜，病毒病是危害我國大白菜生產的主要病害，其中，蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus， 簡稱TuMV）是主要病原[1]。傳統的大白菜抗TuMV育種方法周期長、效率低、選擇準確性差，利用分子標記輔助選擇可大大加快育種進程，提高選擇效率和準確率。

近年來，國內外已開展了一些與大白菜TuMV抗性相關的分子標記研究。閆瑾琦[2]篩選到2個與大白菜抗TuMV基因緊密連鎖的RAPD標記，連鎖距離分別為9.5 cM和15.36 cM。韓和平等[3]采用AFLP方法，篩選到2個與大白菜TuMV感病基因緊密連鎖的AFLP標記，連鎖距離分別為7.5 cM和8.4 cM。張俊華等[4]篩選出2個與大白菜TuMV抗病基因連鎖的EST-PCR-AFLP標記，連鎖距離均為6.5 cM。張曉偉等[5]采用多模型QTL作圖的方法，檢測到3個與大白菜抗TuMV相關的QTLs （Tu-1、Tu-2和Tu-3）， AFLP標記E36M47-7 （2.9 cM）、E33M60-5 （0.5 cM） 和E36M59-5 （2.4 cM） 分別與上述三個QTLs連鎖。Rusholme 等[6]的研究表明，RFLP標記pN202e1與定位在大白菜4號染色體上的隱性TuMV抗性基因retr01共分離；RFLP標記pO52e2 和 pO85e1與定位在大白菜8號染色體上的顯性TuMV抗性基因ConTR01共分離。Qian等[7]報道，Indel標記BrID10694 （0.3 cM）和 BrID101309 （0.6 cM）與大白菜隱性TuMV抗性基因retr02緊密連鎖，且分別位于該基因的兩側。Jin等[8]的研究結果顯示，SSR標記H132A24-s1 （0.2 cM）和KS10960 （0.6 cM）分別與大白菜顯性TuMV抗性基因TuRB07緊密連鎖并位于該基因的兩側。本課題組鑒定出了兩個大白菜TuMV抗性基因——隱性TuMV抗性基因retr02[9] 和顯性TuMV抗性基因TuRBCS01[11]，篩選到一個與retr02緊密連鎖的SSR標記HCC259（3.8 cM）[12]和9個與TuRBCS01緊密連鎖的SSR或InDel標記，其中SSR標記mBr4055和InDel標記BrID10723分別位于TuRBCS01基因的兩側，與該基因的連鎖距離分別為0.6 cM和1.3 cM[13]。

對分子標記檢測準確率的研究，有利于更好地將其用于分子標記輔助選擇。Piao等[14]的研究表明，與大白菜抗根腫病基因CRb緊密連鎖的共顯性標記 TCR01 能夠準確鑒定出純合抗性植株。張晶等[15]利用小麥春化基因特異性標記Vrn-D1對石麥 12 與石家莊 8 號雜交后代 F2∶3株系進行冬、春性鑒定，結果與表型鑒定結果一致。焦荻等[16]利用西瓜抗枯萎病基因SNP標記，對兩個四倍體西瓜材料（易感病的 NF3 為受體，抗病的 JH 為供體）回交后自交群體BC1F2代673 個單株進行檢測，結果表明，檢測到的純合基因型抗病單株與表型鑒定結果一致。目前，尚未見利用大白菜抗TuMV分子標記進行輔助選擇技術研究的報道。

本研究通過構建大白菜抗TuMV材料8407和感病材料冠291的F2∶3家系，對每個F2∶3家系的TuMV抗性進行鑒定，進而判斷原F2代單株的TuMV抗性及基因型，結合標記檢測結果，對標記檢測的準確率進行分析，旨在為利用大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01兩側緊密連鎖的分子標記進行該基因的輔助選擇奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料與毒源

抗病親本材料為大白菜TuMV國家級抗源材料8407，感病親本材料為高感TuMV的核心種質材料冠291，以兩親本構建的F2代107個單株及F2代單株自交構建的F2∶3家系為研究對象，用于大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01分子標記輔助選擇技術研究。

將上述材料播種于直徑7～8 cm的營養缽中，選用德國大漢（Klasmann-Deilmann）泥炭營養土育苗培養，人工氣候室溫度為25℃，濕度40%～60%，光照強度9 000～10 000 lx，光照時間每天11.5 h。

毒源為引自中國農業科學院蔬菜花卉研究所的TuMV-C4株系，接種前一個月在感病材料上繁毒，病葉用于接種親本對照及試驗材料。

1.2基因組DNA提取

采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒對大白菜F2代107個單株樣品的基因組DNA進行提取，具體步驟如下：

（1）取滅菌的2 mL EP管，每管加入直徑為3 mm陶瓷珠4個，稱取供試樣品新鮮幼嫩葉片0.1 g，置于EP管中，加入液氮充分研磨。（2）加入400 μL緩沖液FP1和RNase A （10 mg/mL） 6 μL，渦旋振蕩1 min，室溫放置10 min。（3）加入130 μL緩沖液FP2，充分混勻，渦旋振蕩1 min。（4）12 000 r/min離心5 min，將上清轉移至新的離心管中。（5）向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻，此時會出現絮狀基因組DNA。12 000 r/min離心2 min，棄上清，保留沉淀。（6）加入70%乙醇600 μL，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心2 min，棄上清。（7）重復步驟6。（8）開蓋倒置，室溫靜置5～10 min，徹底晾干殘余的乙醇。（9）加入適量洗脫緩沖液TE，65℃水浴10～60 min溶解DNA，其間顛倒混勻數次助溶，最終得到DNA溶液。

用分光光度計測定所提取DNA的濃度和純度，并用1%瓊脂糖膠進行電泳檢測。使用前用去離子水將其稀釋至70 ng/μL。

1.3引物序列

試驗所用引物為基因TuRBCS01兩端的SSR標記mBr4055和InDel標記BrID10723，其中引物mBr4055的上下游序列分別為5′-GGGTTCTCGGCTACTGGACT-3′和5′-TCATCATGAGACACATCCTCTCC -3′，引物BrID10723的上下游序列分別為5′-GCTTTCCTCGTGTCATTAGA-3′和5′-CTTTCCGAGTTTCCATAGTG -3′。

1.4PCR擴增

PCR擴增在美國ABI SimpliAmp PCR儀上進行。擴增體系為10 μL：2×Taq Master Mix 5 μL，0.5 μmol/L正向引物1 μL，0.5 μmol/L反向引物1 μL，模板DNA（濃度為70 ng/μL）1 μL；雙蒸水（ddH2O）2 μL。PCR擴增程序： 95℃預變性4 min；94℃變性60 s，退火45 s（退火溫度需要隨著擴增引物的變更而進行調整），72℃延伸45 s，此過程共進行30個循環（循環數也可根據PCR擴增引物的不同而進行微調）；72℃延伸10 min，PAGE檢測或4℃保存備用。若需將PCR產物隔夜放置，可將其置于-20℃條件下保存。

1.5PCR擴增產物檢測

采用濃度為8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（29∶1）對PCR擴增產物進行電泳檢測。所用電泳儀為美國Labnet International公司Power Station200型，電泳槽為北京六一的DYCZ-24B型。175～190 V恒壓電泳1.5～3.0 h。銀染檢測電泳結果。

1.6病毒接種

待大白菜苗長至三葉一心時，采用摩擦接種法，對上述試驗材料及對照接種TuMV-C4，具體方法參見李巧云等[10]的方法，三周后進行抗病性調查鑒定。

1.7抗病性鑒定

采用生物學觀察法對F2∶3家系的TuMV抗性進行鑒定，單株病級及病情指數的計算方法參考標準GB/T 19557.5—2004，根據F2∶3家系的病情指數判斷原F2單株的抗性，進而推測該單株的基因型。

1.8數據統計分析

與親本8407擴增帶型一致的單株基因型記為A；與親本冠291擴增帶型一致的單株基因型記為B；雜合帶型記為H。F2單株的TuMV抗性根據F2∶3株系的病情指數來判斷，病情指數為“0”的，單株基因型記為AA；病情指數在0～55.55之間的，單株基因型記為Aa；病情指數在55.55以上的，單株基因型記為aa。根據單株抗病性鑒定和PCR擴增結果，分析基因TuRBCS01兩側標記mBr4055和BrID10723的檢測準確率。

2結果與分析

2.1大白菜基因組DNA提取

提取的樣品基因組DNA經1%瓊脂糖膠電泳檢測無拖尾現象（圖1），分光光度計測定其OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，說明DNA提取質量較高，可用于PCR擴增。

M：DNA Marker；1～10：部分大白菜F2代單株

3討論與結論

對于那些性狀鑒定受多種因素影響、難以在F2代或BC1代確保單株性狀鑒定準確無誤的標記，為了更好地用于分子標記輔助選擇，有必要進一步通過F2∶3家系的性狀鑒定驗證其鑒定準確率。

張晶[15]、焦荻[16]等分別利用F2：3家系和BC1F2代對標記的有效性進行了驗證。Piao等[14]利用與大白菜根腫病抗性基因CRb緊密連鎖的共顯性標記TCR01和TCR05檢測37個根腫病抗性品種和10個非根腫病抗性品種，結果表明，擴出標記條帶TCR01200和TCR05279的18個品種均為抗病品種，而沒有擴出上述兩條帶的品種，有的是抗病品種，有的不是抗病品種。表明標記TCR01和TCR05可選擇性地用于抗病品種的篩選。

本研究通過對大白菜抗TuMV材料8407和感病材料冠291的F2∶3家系的性狀鑒定確定原F2單株的基因型，結合基因TuRBCS01兩側標記mBr4055和BrID10723的單株擴增，檢測兩標記對F2代單株的鑒定準確率。結果表明，利用兩標記檢測純合抗病株，效果最好，檢測準確率為90.9%；其次是雜合抗病株和純合感病株，檢測準確率分別為79.2%和78.3%。上述檢測結果為更好地利用以上兩標記進行分子標記輔助選擇奠定了基礎。

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收稿日期：2016-11-23

基金項目：國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-07-13.5-A11）；山東省現代農業產業技術體系雜糧創新團隊專項（SDAIT-15-03）；山東省重大科技專項（2015ZDJS03001-2）

作者簡介：于淑婷（1990-），女，碩士研究生，研究方向為谷子栽培生理。E-mail：yust1123@126.com

通訊作者：管延安（1965-）