利用16S rDNA克隆文庫研究豬場(chǎng)污水微藻凈化后菌群的變化

盛清凱++劉艷艷++孫中亮+++孫利芹++劉雪++朱昌雄

摘要：為促進(jìn)豬場(chǎng)污水治理，研究微藻凈化對(duì)豬場(chǎng)污水菌群的影響，將小球藻接種于含60%沼液與40%水的豬場(chǎng)污水進(jìn)行批式模式培養(yǎng)，循環(huán)三次后將小球藻液離心，檢測(cè)豬場(chǎng)污水、小球藻液以及離心后上清液中的水質(zhì)指標(biāo)及菌群變化情況。菌群采用16S rDNA克隆文庫方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，和豬場(chǎng)污水相比，小球藻液及上清液中的化學(xué)耗氧量（COD）、總氮、氨氮、總磷、銅、鋅等含量極顯著降低（P<0.01）。除未知菌群外，豬場(chǎng)污水中的主要菌群為Firmicutes 群和Bellilinea群，含量分別為12.25%和11.22%；小球藻液中主要菌群為小球藻和Cytophaga 群，含量分別為42.42%和12.12%；上清液中的主要菌群為Dyadobacter、Cytophaga、Algoriphagus 群和Pedobacter 群，含量分別為25.00%、14.00%、11.00%和10.00%。豬場(chǎng)污水和小球藻液中未發(fā)現(xiàn)共存的微生物，小球藻液與上清液中皆含有Cytophaga群和Dyadobacter、Pseudomonas、Flavobacterium、Algoriphagus、Flexibacter群。表明接種小球藻可以凈化豬場(chǎng)污水中的氨氮、總磷以及重金屬，改變污水中的菌群，污水凈化可能是小球藻和其共存菌共同作用的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：小球藻；豬場(chǎng)污水；16S rDNA克隆文庫；凈化；菌群

中圖分類號(hào)：S828.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）02-0093-06

隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，糞污污染問題日益引起人們的重視。隨著2015年國家《水污染防治行動(dòng)計(jì)劃》及2016年國家《土壤污染防治行動(dòng)計(jì)劃》的實(shí)施，糞尿處理問題尤其需要解決。由于總體畜禽養(yǎng)殖利潤低、污水處理設(shè)施投入高、處理后的水價(jià)格低，且養(yǎng)殖戶處理污水的意愿不高，養(yǎng)殖污水處理成為目前養(yǎng)殖污染處理的難點(diǎn)之一。和城市污水、工業(yè)污水相比，養(yǎng)殖污水量大，氮、磷含量高，水體微生物成分復(fù)雜，且可能含有致病菌，因此養(yǎng)殖污水處理難度更大。

微藻因適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，能夠利用污水中的氮、磷[1]，并且具有抗腫瘤、抗高血壓[2，3]等生理功能而受到畜禽養(yǎng)殖業(yè)的廣泛關(guān)注。利用微藻處理污水不但可以降低污水處理設(shè)施的高投入，而且可以用廉價(jià)的污水生產(chǎn)高附加值的微藻飼料、微藻保健品等。微藻自20世紀(jì)70年代起開始用于污水處理[4]。菌藻共生技術(shù)的出現(xiàn)進(jìn)一步提升了微藻處理污水的效果[5]。由于微藻處理污水的效果受水體中微生物以及外源微生物的影響[6]，明確微藻凈化污水過程中微生物的變化有助于進(jìn)一步明確微藻凈化污水的機(jī)理、提升菌藻共生技術(shù)、增強(qiáng)污水處理效果及促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)水資源的高效利用。但養(yǎng)殖污水中微生物種類及含量不明，制約了其高效利用。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大、絕大多數(shù)微生物不能培養(yǎng)等缺點(diǎn)，無法準(zhǔn)確確定污水中的微生物。16S rDNA克隆文庫不需要環(huán)境中微生物的純培養(yǎng)，能夠更全面系統(tǒng)地揭示各種未知的微生物，目前已應(yīng)用于油田及燃料[7]等，但尚未見用于養(yǎng)殖污水的報(bào)道。本研究采用16S rDNA克隆文庫技術(shù)分析微藻凈化的豬場(chǎng)污水中菌群的變化，可為豬場(chǎng)污水治理提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

小球藻（Chlorella vulgaris），煙臺(tái)大學(xué)提供。豬場(chǎng)污水，煙臺(tái)市某豬場(chǎng)提供，為60%沼液與40%水。Stool DNA試劑盒，美國OMEGA公司生產(chǎn)。pMD18-T Vector試劑盒以及Ex Taq HS DNA熱啟動(dòng)聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司提供。GenEluteTM Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，美國Sigma Aldrich公司生產(chǎn)。

1.2小球藻凈化豬場(chǎng)污水及水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)

將小球藻接種于1.5 L以豬場(chǎng)污水為培養(yǎng)液的柱狀光生物反應(yīng)器中，小球藻初始接種濃度為OD680=0.3，人工光源24 h連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為150 μmol/（m2·s），培養(yǎng)溫度為23～28℃，空氣流量為0.2 L/min。培養(yǎng)開始時(shí)采用批式模式培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液中污染物濃度降低至《畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》所規(guī)定的允許排放濃度以下時(shí)，再用50%體積比的豬場(chǎng)污水以50%的體積比置換培養(yǎng)液，繼續(xù)進(jìn)行光照培養(yǎng)，如此循環(huán)三次。最終將小球藻溶液5 000 r/min離心10 min后收集上清液。利用小球藻共凈化豬場(chǎng)污水三批，每批將豬場(chǎng)污水、最終的小球藻液、離心后的上清液樣品各采集三個(gè)重復(fù)，用于水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)。

COD根據(jù)GB/T 11914—1989檢測(cè)，總氮含量根據(jù)HJ 636—2012檢測(cè)，氨氮含量根據(jù)HJ 535—2009檢測(cè)，總磷含量根據(jù)GB/T 11893—1989檢測(cè)，銅與鋅含量采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定。

1.316S rDNA克隆、轉(zhuǎn)化和文庫構(gòu)建

1.3.1DNA提取及PCR擴(kuò)增將豬場(chǎng)污水、最終的小球藻溶液、離心后的上清液三個(gè)樣品12 000 r/min離心5 min，收集菌體后， 使用試劑盒抽提DNA。

利用引物27F/16SF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R/16SR：5′-GGYTACCTTGTTACGACT T-3′ 擴(kuò)增16S rDNA。

PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：模板DNA，2 μL；Ex Taq HS DNA熱啟動(dòng)聚合酶，0.25 μL；10×buffer，5 μL；27F/1492R（10 μmol/L），各2 μL；最后用無菌超純水補(bǔ)足至50 μL。

PCR反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性3 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

用GenEluteTM Gel Extraction Kit膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.3.2PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化和克隆文庫構(gòu)建根據(jù)pMD18-T Vector試劑盒說明和分子克隆方法連接PCR產(chǎn)物并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。用X-gal/IPTG AMP抗性篩選平板選擇具有氨芐抗性的白斑單克隆轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，通過M13通用引物（正反方向）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，選取擴(kuò)增片段大小在1 700 bp左右的陽性克隆構(gòu)建16S rDNA文庫。

1.3.316S rDNA克隆文庫測(cè)序及分析對(duì)構(gòu)建的3個(gè)16S rDNA克隆文庫中經(jīng) M13通用引物鑒定后的陽性克隆質(zhì)粒（每個(gè)克隆文庫篩選110個(gè)陽性克隆子）進(jìn)行測(cè)序。對(duì)每個(gè)克隆子的正反向測(cè)序結(jié)果使用DNAStar軟件進(jìn)行拼接，去除載體序列。將序列在Unix系統(tǒng)服務(wù)器上進(jìn)行本地BLAST數(shù)據(jù)庫比對(duì)，將代表序列使用MEGA5.2軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SAS （V9.1） 軟件對(duì)水質(zhì)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；采用ONE-WAY ANNOVA進(jìn)行方差分析；采用Student-Newmnan-Keuls法進(jìn)行多重比較，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1小球藻對(duì)豬場(chǎng)污水的凈化效果

與豬場(chǎng)污水相比，小球藻液中的COD、總氮、氨氮、總磷、銅及鋅含量分別降低23.08%、56.24%、72.37%、66.21%、84.62%及90.57%，上清液中的COD、總氮等含量進(jìn)一步降低，彼此差異極顯著（P<0.01）。

3討論與結(jié)論

沼氣工程是目前常用的處理糞水的方法之一。然而由于資金、技術(shù)及環(huán)境等多種因素的制約，大量沼氣工程未能實(shí)際運(yùn)行或運(yùn)行效果差，許多豬場(chǎng)將沼氣池中未發(fā)酵的沼液與沼氣池外的豬糞水混在一起外排，沼液、沼渣成為一種新的污染源。本試驗(yàn)用小球藻凈化沼液，有助于豬場(chǎng)污水的高值化利用。

本試驗(yàn)用小球藻處理沼液污水后氮、磷含量皆降低，其凈化效果與其它報(bào)道[8]結(jié)果相似。氮磷含量降低的機(jī)理與小球藻的增殖有關(guān)[9]。藻類在生長(zhǎng)過程中以CO2為碳源，吸收污水中的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，通過藻類細(xì)胞中葉綠素的光合作用生成藻類自身的營養(yǎng)物質(zhì)，完成藻類細(xì)胞的增殖。

小球藻的增殖對(duì)豬場(chǎng)污水中菌群的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小球藻增殖后，污水中的菌群組成發(fā)生了改變。豬場(chǎng)污水中的主要菌群為厚壁菌（Firmicutes）及綠彎菌（Bellilinea），二者在沼氣發(fā)酵過程中發(fā)揮了重要功能[10，11]。小球藻液中未發(fā)現(xiàn)這兩種主要菌以及Rhodopseudomonas、Longilinea等次要菌群。小球藻液中除小球藻外主要的菌群為擬桿菌門菌（Cytophaga）。污水中厚壁菌（Firmicutes）及綠彎菌（Bellilinea ）的消失與小球藻的增殖可能存在關(guān)聯(lián)。小球藻液與上清液中皆含有主要菌群Cytophaga 以及次要的Dyadobacter、Pseudomonas、Flavobacterium、 Algoriphagus、Flexibacter等菌群。上清液中Dyadobacter、Pseudomonas等次要菌群含量的增加應(yīng)與小球藻的離心有關(guān)。小球藻可能通過其分泌的球藻素[12，13]影響污水及上清液中其它菌的生長(zhǎng)。

小球藻增殖后污水中菌群的功能也發(fā)生了變化。小球藻液中的擬桿菌門菌（Cytophaga）與纖維素降解[14]及氮硝化[15]有關(guān)。苗禎等[16]報(bào)道北極小球藻的藻際環(huán)境內(nèi)也有Cytophaga。小球藻與Cytophaga之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。小球藻液中Dyadobacter可能與COD及氮磷的去除有關(guān)[16-18]。小球藻液中變形菌門假單胞菌屬（Pseudomonas）也與COD去除及氮磷代謝有關(guān)[18]，Pseudomonas與小球藻在無機(jī)氮與有機(jī)碳的去除上存在菌藻共生協(xié)同現(xiàn)象[19]。小球藻液中的Methylobacillus flagellatus KT與氧化酶[20，21]及磷[22]的代謝相關(guān)。小球藻可能和其溶液中的Cytophaga、Pseudomonas等菌或其它未知菌形成藻菌聯(lián)合體[23]共同去除污水中的氮、磷或其它物質(zhì)。

綜上，接種小球藻可以凈化豬場(chǎng)污水中的氨氮、總磷，改變污水中的菌群。污水凈化可能是小球藻和其共生菌共同作用的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tam N F Y， Lau P S， Wong Y S. Wastewater inorganic N and P removal by immobilized Chlorella vulgaris[J]. Water Science & Technology， 2015，30（6）：369-374.

[2]Renju G L， Kurup G M， Bandugula V R. Effect of lycopene isolated from Chlorella marina on proliferation and apoptosis in human prostate cancer cell line PC-3[J]. Tumor Biology， 2014， 35（11）：10747-10758.

[3]Shimada M， Hasegawa T， Nishimura C， et al. Anti-hypertensive effect of gamma-aminobutyric acid （GABA）-rich Chlorella on high-normal blood pressure and borderline hypertension in placebo-controlled double blind study[J]. Clinical and Experimental Hypertension， 2009，31（4）：342-354.

[4]Kim S B， Lee S J， Yoon B D， et al. Selection of microalgae for advanced treatment of swine wastewater and optimization of treatment condition[J]. Microbiology and Biotechnology Letters， 1998， 26（1）：76-82.

[5]簡(jiǎn)恩光.小球藻和菌藻共生系統(tǒng)綜合處理養(yǎng)豬業(yè)沼液研究[D].南昌：南昌大學(xué)， 2013.

[6]畢向東.小球藻與優(yōu)勢(shì)共棲異養(yǎng)細(xì)菌間的相互作用及其對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的響應(yīng)[D]. 青島： 中國海洋大學(xué)， 2013.

[7]Madelaine Q E. Selecting and characterizing bacterial consortia with the potential of fixing CO2 and removing H2S in a biogas atmosphere[J]. Water Air & Soil Pollution， 2014， 225 （5）：1-9.

[8]Huang X P， Guo J S， Chen C L， et al. Control the pollution of pig farms manure wastewater and resource to cultivate microalgae[J]. Advanced Materials Research， 2014， 1015：725-728.

[9]黃魁. 藻類去除污水中氮磷及其機(jī)理的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2007.

[10]馮蕾，陳競(jìng)，代金平，等. 兩種膠濃度PCR-DGGE方法對(duì)不同處理羊糞低溫沼氣發(fā)酵優(yōu)勢(shì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)多樣性的分析[J]. 中國沼氣，2014，32（6）：9-15.

[11]張小妹.以含氮雜環(huán)化合物為碳源短程反硝化厭氧產(chǎn)甲烷及復(fù)合工藝的特征分析與性能研究[D].太原：太原理工大學(xué)，2015.

[12]Dellagreca M， Zarrelli A， Fergola P， et al. Fatty acids released by Chlorella vulgaris and their role in interference with Pseudokirchneriella subcapitata： experiments and modelling[J]. Journal of Chemical Ecology， 2010， 36（3）： 339-349.

[13]Guo Z， Tong Y W. The interactions between Chlorella vulgaris and algal symbiotic bacteria under photoautotrophic and photoheterotrophic conditions[J]. Journal of Applied Phycology， 2014， 26（3）：1483-1492.

[14]Yang T， Bu X， Han Q， et al. A small periplasmic protein essential for Cytophaga hutchinsonii cellulose digestion[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2016， 100（4）：1935-1944.

[15]Logemann S， Schantl J， Bijvank S， et al. Molecular microbial diversity in a nitrifying reactor system without sludge retention[J]. FEMS Microbiology Ecology，1998，27（3）：239-249.

[16]苗禎，杜宗軍，李會(huì)榮，等. 5株北極微藻藻際環(huán)境的細(xì)菌多樣性[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35（5）：1587-1600.

[17]毛丹丹.生活污水活性污泥中菌群結(jié)構(gòu)分析及功能菌的分離與培養(yǎng)[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2012.

[18]張艷麗. 滇池浮游細(xì)菌的時(shí)空分布及優(yōu)勢(shì)菌對(duì)鉛、鎘的吸附效果[D].昆明：云南大學(xué)，2012.

[19]Mujtaba G， Rizwan M， Lee K. Simultaneous removal of inorganic nutrients and organic carbon by symbiotic co-culture of Chlorella vulgaris， and Pseudomonas putida[J]. Biotechnology & Bioprocess Engineering， 2015， 20（6）：1114-1122.

[20]Strom E V， Dinarieva T Y，Netrusov A I. The cytochrome cbo from the obligate methylotroph Methylobacillus flagellatus KT is a cytochrome c oxidase[J]. Microbiology， 2004， 73（2）：124-128.

[21]Muntyan M S， Dinarieva T Y， Baev M V， et al. Effect of growth conditions on the synthesis of terminal oxidases in Methylobacillus flagellatus KT[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2002， 398（1）：118-124.

[22]But S Y， Khmelenina V N， Reshetnikov A S， et al. Bifunctional sucrose phosphate synthase/phosphatase is involved in the sucrose biosynthesis by Methylobacillus flagellatus KT [J]. FEMS Microbiology Letters， 2013， 347（1）：43-51.

[23]Su Y， Mennerich A， Urban B. Municipal wastewater treatment and biomass accumulation with a wastewater-born and settleable algal-bacterial culture[J]. Water Research， 2011， 45（11）： 3351-3358.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2017，49（2）：99～104Shandong Agricultural Sciences山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)第49卷第2期梁強(qiáng)，等：泰安市不同綠地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.02.021