鮭魚降鈣素溫度敏感型原位凝膠的制備與評(píng)價(jià)*

王小寧，常體偉，屈 勇，張存勞

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

降鈣素(calcitonin，CT)是一種32肽的激素，它是由甲狀腺內(nèi)的濾泡旁細(xì)胞(C細(xì)胞)以及其它脊椎動(dòng)物的腮腺分泌的，其具有強(qiáng)力的抑制骨吸收的作用，能直接抑制破骨細(xì)胞的活性，刺激成骨細(xì)胞的形成，加快鈣在骨骼中的沉積，因此在治療骨質(zhì)疏松癥方面顯示了良好的療效[1]。目前臨床常用的為鮭魚降鈣素(Salmon Calcitonin，sCT)，活性比人降鈣素強(qiáng)數(shù)十倍[2]。作為大分子多肽類藥物，降鈣素在胃腸道易被降解，因此給藥方式受限，目前上市的降鈣素劑型有注射劑和鼻噴劑兩種。但注射劑和鼻噴劑給藥后，藥物達(dá)峰快，半衰期短，維持作用時(shí)間短，患者順應(yīng)性差。由于降鈣素不能口服以及注射后藥物半衰期短的不足，研究其緩控釋劑型就顯得尤為重要。

溫敏凝膠在室溫下是溶液狀態(tài)，可通過皮下注射給藥，由于環(huán)境條件的改變而發(fā)生相轉(zhuǎn)變形成半固態(tài)的凝膠。載藥凝膠長時(shí)間與作用部位發(fā)生緊密接觸，緩慢地、持續(xù)地釋放藥物，可避免首過效應(yīng)，減少給藥次數(shù)，延長藥物生物半衰期，提高藥物的生物利用度，因此作為蛋白多肽類藥物的緩控釋給藥系統(tǒng)具有一定應(yīng)用前景[3-4]。作者的目的在于制備一種以殼聚糖(chitosan)和葡萄糖磷酸二鈉(disodium Glucose phosphate，GP)為基質(zhì)材料的鮭魚降鈣素溫度敏感型原位凝膠，并對(duì)該凝膠的處方篩選、體外釋放以及生物相容性進(jìn)行研究，為開發(fā)降鈣素的緩釋給藥制劑奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鮭魚降鈣素原料藥(sCT)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，上海肽仕生物科技有限公司；殼聚糖：相對(duì)分子質(zhì)量507 kD，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；葡萄糖磷酸二鈉(GP)：西格瑪奧德里奇公司；鮭魚降鈣素ELISA試劑盒：A03727，上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；GS-E90003胎鼠成纖維細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞代數(shù)為第4代，西安醫(yī)學(xué)院藥理教研室；Dulbecco’s modified Eagle 高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胰酶：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%，脈晨科技有限公司；特級(jí)胎牛血清(FBS)：美國Gibco公司；羅丹明B(SRB)：Sigma-Aldrich公司；MTT：Sigma-Aldrich公司；Tris：生工生物科技有限公司；TritonX-100：Amresco公司。

超凈工作臺(tái)：VS-840K-U，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡：XDS-1B，COIC公司；低速臺(tái)式離心機(jī)：TD24-WS，湘儀離心機(jī)有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱：HF-90，上海力申科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀：model 550，美國Bio-Ran公司。

1.2 凝膠溶液的制備

1.2.1 凝膠溶液的制備

在室溫下，將葡萄糖磷酸二鈉溶液在攪拌條件下滴入殼聚糖溶液中，得到的混合溶液繼續(xù)攪拌10 min得到均一澄清透明的溶液。

1.2.2 載藥凝膠溶液的制備

在室溫下，將計(jì)算量的鮭魚降鈣素分散于殼聚糖溶液中，制得含藥的殼聚糖溶液。將葡萄糖磷酸二鈉溶液在攪拌條件下滴入含藥殼聚糖溶液中，得到的混合溶液繼續(xù)攪拌10 min得到載藥凝膠溶液。

1.3 膠凝溫度及膠凝時(shí)間的測定

采用試管翻轉(zhuǎn)法來考察不同比例殼聚糖、葡萄糖磷酸二鈉溶液的溶液-凝膠相變[5]。將裝有聚合物溶液的試管浸入恒溫水浴中，在30～45 ℃范圍內(nèi)觀察溶液的膠凝溫度，升溫間隔為1 ℃。溶液在每個(gè)溫度下放置20 min后，通過翻轉(zhuǎn)試管觀察溶液的狀態(tài)來確定溶液是否膠凝，當(dāng)溶液不可流動(dòng)時(shí)的溫度即為膠凝溫度，從試管放入水浴中到達(dá)到膠凝點(diǎn)所經(jīng)歷的時(shí)間即為膠凝時(shí)間。

1.4 ρ(鮭魚降鈣素)測定方法的建立

樣品采用鮭魚降鈣素酶免分析試劑盒進(jìn)行定量分析[6]。精密稱取鮭魚降鈣素5 mg，置于25 mL的棕色容量瓶中，加入適量注射用水溶解，定容即得ρ(鮭魚降鈣素)為200 μg/mL的溶液；精密量取250 μL的上述溶液，置于25 mL的棕色容量瓶中，加入適量注射用水溶解，定容即得ρ(鮭魚降鈣素)為2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL于反應(yīng)孔、加入待測樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。清洗酶標(biāo)板5次，每孔加入80 μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。清洗酶標(biāo)板5次，每孔加入底物顯色劑和終止液各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育15 min。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應(yīng)立即在450 nm波長處測定各孔的OD值。用ELISA法檢測樣品時(shí)均扣除了空白溶液樣品本底。

1.5 溫敏凝膠的處方篩選

以累積釋放度為指標(biāo)，以對(duì)體外釋放度影響較大的因素殼聚糖黏度(A)、ρ(殼聚糖)(B)、ρ(葡萄糖磷酸二鈉)(C)為考察因素進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，采用綜合評(píng)分法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，進(jìn)行溫敏凝膠的處方篩選。

1.5.1 累積釋放度的測定方法

計(jì)算累積釋藥量，計(jì)算累積釋放度。其中，ρ為樣品濃度，Q為累積釋放量，i和n分別為取樣次數(shù)。

1.5.2 正交實(shí)驗(yàn)

選擇對(duì)體外釋放度影響較大的因素殼聚糖黏度(A)、ρ(殼聚糖)(B)、ρ(葡萄糖磷酸二鈉)(C)為考察因素進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，采用綜合評(píng)分法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析(是實(shí)驗(yàn)對(duì)不同處方1、6、12 h的釋放度進(jìn)行評(píng)價(jià))，再將評(píng)分結(jié)果進(jìn)行加權(quán)相加后得出總分，各點(diǎn)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：1 h為|Q1 h-15%|，6 h為|Q6 h-45%|，12 h為|Q12 h-90%|，計(jì)算公式為：Y=|Q1 h-15%|+|Q6 h-45%|+|Q12 h-90%|，Y小者為優(yōu)，最小時(shí)最佳[8]。最后采用直觀分析和方差分析的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，因素水平見表1。

表1 因素及水平

1.6 體外釋藥

按1.5.1項(xiàng)下的累積釋放度測定方法，以最優(yōu)處方為凝膠基質(zhì)，考察了載有不同ρ(鮭魚降鈣素的凝膠)(10、15、20 mg/mL)在PBS溶液中的釋放情況，以各處方累積釋放百分率對(duì)時(shí)間作圖，繪制釋放曲線。

1.7 生物相容性研究

1.7.1 凝膠浸提液的制備

于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1 mL的溶液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，待其形成凝膠后，每孔加入2 mL的DMEM完全培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)，分別浸提24、48、72 h，取出6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸取凝膠上清液，即為浸提液。ρ(浸提液)按比例稀釋成為100、50、10、1 mg/mL的浸提液，備用。

1.7.2 凝膠浸提液細(xì)胞毒性的測定

SRB法檢測水凝膠浸提液的細(xì)胞相容性[9]。取傳至第4代的胎鼠成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為4×104個(gè)/mL，制成細(xì)胞懸液。將配制好的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，100 μL/孔，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于細(xì)胞培養(yǎng)的第3天進(jìn)行浸提液毒性的測定。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，加入200 μL DMEM培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，10 mg/mL TritonX-100為陽性對(duì)照，加入浸提3 d的一系列濃度的浸提液作為實(shí)驗(yàn)組，每組6孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，PBS清洗一遍，加入200 μL預(yù)冷的φ(三氯醋酸)=10%固定，將培養(yǎng)板移至4 ℃放置1 h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，37 ℃烘干。每孔加入100 μL SRB液，在室溫放置10 min，未與蛋白質(zhì)結(jié)合的SRB用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用200 μL 10 mmol/L非緩沖Tris堿液(pH=10.5)振蕩溶解。于BIO-TEK酶標(biāo)儀測定各孔的OD值，測定波長為540 nm。根據(jù)各孔OD值計(jì)算細(xì)胞的存活率。計(jì)算公式如下：細(xì)胞相對(duì)存活率%=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 ρ(鮭魚降鈣素)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白溶液0.2 mL，分別加入鮭魚降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品適量，使其質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80、120、160、200 μg/L；按2.2中所述方法，進(jìn)行分析測定，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，記錄光密度OD，以光密度OD對(duì)質(zhì)量濃度ρ做線性回歸分析，得回歸方程為：OD=0.038 58ρ-0.539 7，r2=0.996 5。鮭魚降鈣素濃度檢測方法的檢測范圍為5～200 μg/L，最低檢測濃度為5 μg/L。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

表3 方差分析1)

1)F0.1(2，2)=9.00，F(xiàn)0.05(2，2 )=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00。

由表2、表3可見，各因素對(duì)凝膠體外釋藥的影響程度依次為A>B>C，且A對(duì)體外累積釋放度有顯著影響(P<0.05)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，溫敏凝膠的最優(yōu)處方為A2B2C1，即殼聚糖黏度為200～400 mPa·s，ρ(殼聚糖)=12 mg/mL，ρ(葡萄糖磷酸二鈉)=100 mg/mL。

2.1.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按A2B2C1最優(yōu)處方制備溫敏凝膠，各平行制備3份，測定其膠凝溫度、膠凝時(shí)間和體外累積釋放度，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以最優(yōu)處方制備的溫敏凝膠膠凝溫度為(35.3±0.2)℃，膠凝時(shí)間為(13.7±0.6)min，1 h體外累積釋放度為(13.9±0.1)%，沒有藥物的突釋現(xiàn)象，6 h時(shí)累積釋放度為(42.9±0.2)%，具有緩釋效果，12 h時(shí)累積釋放度為(90.2±0.3)%，釋放較完全，綜合評(píng)分為3.8±0.1，該值比所有的正交實(shí)驗(yàn)值都要小，說明處方優(yōu)化結(jié)果較好。

2.1.4 體外釋藥

不同ρ(鮭魚降鈣素的凝膠)(20、15、10 mg/mL)的釋放曲線見圖1。

t/h圖1 不同載藥量凝膠處方的體外釋藥曲線

從體外釋放曲線可以看出，在釋放開始的前1 h內(nèi)，各處方凝膠分別釋放了(14.46±1.91)%，(13.12±1.63)%，(10.57±2.02)%的鮭魚降鈣素，顯示了較快的藥物釋放速率，隨后的釋放減緩，在6 h的釋放時(shí)間內(nèi)，各處方最終都只有不到50%的藥物從凝膠中釋放，說明所制備的凝膠具有良好的緩釋效果。在6 h的釋放過程中，載10和15 mg/mL鮭魚降鈣素的凝膠分別累積釋放了(38.14±6.44)%和(42.14±6.80)%的藥物，兩組間不存在顯著性的差異(P>0.05)；而載20 mg/mL鮭魚降鈣素的凝膠累積釋放了(48.93±3.34)%的藥物，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)20 mg/mL鮭魚降鈣素凝膠的釋藥量均高于另外兩組。12 h后，各處方凝膠分別釋放了(93.70±4.38)%，(89.31±4.60)%，(85.32±4.90)%的鮭魚降鈣素，均體現(xiàn)出較好的緩釋效果。

2.1.5 生物相容性研究

不同濃度凝膠浸提液細(xì)胞毒性的測定結(jié)果見圖2。

由圖2可見，隨著凝膠浸提液濃度的增大，細(xì)胞存活率隨之降低。但是，當(dāng)ρ(凝膠浸提液)范圍在1～50 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率沒有顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)ρ(凝膠浸提液)=1 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為96.9%；當(dāng)ρ(凝膠浸提液)=50 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為92.1%；當(dāng)ρ(凝膠浸提液)=10 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率仍高于80%，為87.4%，但顯著低于ρ(凝膠浸提液)=1 mg/mL時(shí)的細(xì)胞存活率(P<0.05)，作為陽性對(duì)照的10 mg/mL Triton X-100，其細(xì)胞存活率低于26%，具有顯著的細(xì)胞毒性。結(jié)果說明凝膠浸提液在所測定的濃度范圍內(nèi)基本沒有細(xì)胞毒性。

ρ(凝膠浸提液)/(mg·mL-1)圖2 不同濃度凝膠浸提液的細(xì)胞毒性測定結(jié)果(n=6)

2.2 討論

殼聚糖是一種具有生物相容性、生物可降解性以及粘膜黏附性的陽離子生物高分子，以其低免疫原性及低細(xì)胞毒性而受到廣泛關(guān)注[10-11]。殼聚糖可溶解在酸性溶液中，在 pH>6 時(shí)發(fā)生相分離形成凝膠樣沉淀。然而，具有單陰離子基團(tuán)的多元醇鹽(如多元醇或糖的磷酸鹽)的加入可以將單純 pH 依賴膠凝的殼聚糖溶液，轉(zhuǎn)變?yōu)闇囟让舾行偷娜芤海蛊涑蔀闇孛粼荒z非常有潛力的材料之一，并在蛋白多肽類藥物緩控釋系統(tǒng)的研究方面取得了一定進(jìn)展[12]。

近年來，新型生物材料的毒性問題備受關(guān)注，聚合物材料由于在制備過程中會(huì)有有機(jī)溶解殘留以及聚合物材料緩慢降解，因此可能造成蓄積毒性[13]。由于凝膠的降解產(chǎn)物微量存在，因此浸提液的細(xì)胞毒性應(yīng)該大大低于材料溶液的毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。由生物相容性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出，浸提3 d后，ρ(浸提液)=100 mg/mL的細(xì)胞存活率仍然為87.4%，而陽性對(duì)照組10 mg/mL TritonX-100的細(xì)胞存活率僅為25.3%。由浸提液的結(jié)果來看，凝膠的毒性相當(dāng)?shù)停谒幬镝尫蓬I(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化的處方為殼聚糖黏度為200～400 mPa·s，ρ(殼聚糖)=12 mg/mL，ρ(葡萄糖磷酸二鈉)=100 mg/mL。不同載藥量處方體外釋藥結(jié)果顯示，在6 h的釋放時(shí)間內(nèi)，各處方都只有不到50%的藥物從凝膠中釋放，顯示了較好的緩釋效果。生物相容性研究結(jié)果顯示，凝膠浸提液在所測定的濃度范圍內(nèi)基本沒有細(xì)胞毒性，說明此凝膠系統(tǒng)生物相容性好，可應(yīng)用于藥物釋放領(lǐng)域。

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