PCR實驗室的污染與對策

阮艷秋

四川省自貢市第一人民醫(yī)院檢驗科 四川自貢 643000

PCR實驗室的污染與對策

阮艷秋

四川省自貢市第一人民醫(yī)院檢驗科 四川自貢 643000

目的:探討PCR實驗室防止和處理污染的辦法, 方法:從PCR技術對環(huán)境的要求和污染的3個來源分析污染的原因，提出應采取的控制方法和預防措施。結果：有效防止實驗室污染，結論；PCR技術在不斷發(fā)展，隨著新技術的出現(xiàn)，PCR技術及其污染控制策略將會更加完善。

聚合酶鏈反應；污染；控制方法；預防措施

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是由美國Kary Mullis于1983年發(fā)明的[1]。該技術通過重復高溫變性,低溫退火,中溫延伸等簡單的3個溫度循環(huán),能將靶DNA擴增數(shù)百萬倍,獲得極高的檢測敏感性.但令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的結果[2].如果形成氣溶膠污染而擴散,則可引起整個PCR實驗室的污染,處理起來非常麻煩棘手,嚴重的甚至要關閉PCR實驗室.我實驗室也曾經(jīng)遭遇過氣溶膠的污染,所幸的是經(jīng)過一段時間的處理,最終將PCR實驗室污染排除掉了.現(xiàn)將經(jīng)過向大家報告如下。

1.資料與方法

1.1 檢測對象 本院感染科、內(nèi)外科、婦產(chǎn)科、兒科及門病科患者82例，年齡9～76歲。

1.2 檢測方法和儀器 乙型肝炎病毒的DNA檢測方法，均采用達安基因公司 PCR-熒光探針法。試劑貯存和準備區(qū)有 BCJ一 1FD 型潔凈工作臺(上海博迅公司)；標本制備區(qū)BSC-1500II-B2-X

型生物安全柜(上海力申公司)、HC-3018高速冷凍離心機(安徽中科中佳公司)、XK96一A4型快速混勻器(姜堰新康儀器廠)、HB-100恒溫金屬浴（博日科技）；擴增產(chǎn)物分析區(qū)有FTC-2000型實時熒光定量PCR儀(上海楓嶺公司)，3個區(qū)域均備有ZXC-II型紫外線消毒車(上海躍進器械廠)。

1.3 標本采集 無菌試管采集空腹靜脈血 3mL，按說明書要求分離血清保存。

2 污染的發(fā)現(xiàn)

2013年8月5日,我實驗室按正常的操作規(guī)程檢測HBV標本，同時設立了陰性對照、陽性對照和質控，陰陽性對照均為試劑盒中配備，擴增結束分析結果時，發(fā)現(xiàn)HBVDNA所有的標本及陰、陽性對照均為陽性，提示操作過程中出現(xiàn)污，但具體是什么原因引起的污染還不清楚。

3.PCR實驗室污染的監(jiān)測和追蹤

出現(xiàn)污染后，我們首先考慮可能是試劑的污染，更換新批號的HBVDNA試劑重新檢測后,結果仍然為全部標本陽性.將HBV標本拿到其他正規(guī)的PCR實驗室檢測,結果標

本中陰、陽性結果都有，陰性對照是陰性，陽性對照是陽性，說明標本沒有被污染，

將兩種批號的HBV 試劑拿到其他正規(guī)的PCR實驗室檢測,也顯示試劑沒有問題.

我實驗室用消毒液擦拭工作臺面后,打開所有的紫外燈照射一天,將所使用微量進樣器、離心、槍頭進行重新消毒；手套、記號、記錄本等都更換掉。再將HBV標本進行檢測，結果全部標本仍然為陽性。

用消毒液擦拭工作臺面后，打開所有的紫外燈照射一天，將HBV標本重新檢測，同時設置了5個陰性對照，①試劑對照：將試劑的反應管從試劑盒中拿出，不開蓋子，直接上機檢；② 環(huán)境取樣：用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源，用1ml去離子水浸泡，再取5ul做PCR實驗。③氣溶膠?？蓪⒁粋€或多個空管打開靜置于標本制備 10～30分鐘，然后加入擴增反應混合液，④不加任何試劑和樣本，只有相同體積的水。結果是全部標本和②,③陰性對照為陽性,而①和④陰性對照為陰性。

4. 結果

基本可以排除試劑和儀器污染。推斷為實驗室氣溶膠污染。后來經(jīng)過調(diào)查，發(fā)現(xiàn)工作人員在操作過程中有一個強陽性標本溢出，污染了生物安全柜未及時消毒處理所致。

5.污染的排除

在確定了污染的原因后，我們就開始著手排除污染，每天

都打開整個PCR實驗室的門窗和排氣扇,讓整個實驗室換氣通風，可起到空氣稀釋的作用，有利于 PCR產(chǎn)物留量的減少，加快實驗室污染的排除。用現(xiàn)配的3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液

消毒液擦拭整個PCR實驗室所有可能的污染源：實驗臺面、離心機、冰箱門把手、可疑器具等等!用消毒液對生物安全柜進行噴霧，使氣溶膠沉降后,每天重復以上操作三至五次，下班后紫外燈通宵照射，一周后，重復檢查所有轉陰再投入使用，PCR實驗室恢復正常。

6 分析討論

PCR技術的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染。極其微量的污染就可造成假陽性結果，一旦發(fā)生污染，后果不堪設想。要消除污染就是要預見污染、承認污染和采取措施防止污染。通常我們對 PCR實驗室污染的預防是采取操作分區(qū)、試劑的分裝處理、移液器的使用、Eppendorf管、規(guī)范實驗操作等規(guī)則,對污染的處理是用現(xiàn)配3%雙氧水或 10%次氯酸鈉溶液擦拭或浸泡;紫外線照射法[3]。而對于實驗室的通風方面沒有給予足夠的重視，為了防止實驗區(qū)間之間的相互污染，各個實驗區(qū)間都是盡可能的密閉，從而使得實驗室出現(xiàn)PCR產(chǎn)物殘留污染的幾率增大，從本次PCR實驗室污染排除的過程來看，我覺得污染得以排除的一個關鍵是通風，適當?shù)慕o予實驗室通風，可起到空氣稀釋的作用，有利于 PCR產(chǎn)物殘留量的減少，加快實驗室污染的排除。

PCR技術在不斷的發(fā)展，隨著定量 PCR、熒光 PCR、巢式PCR、逆轉錄PCR，特別是生物芯片等技術的出現(xiàn)[4]，[5]，PCR技術及其污染控制策略將會更加完善。

開展 PCR必須具備一定的條件，為保證臨床基因擴增檢驗技術的有效應用，在衛(wèi)生部的指導下。經(jīng)國內(nèi)專家多次研究論證，并結合該技術在國內(nèi)外的發(fā)展現(xiàn)狀，衛(wèi)生部于2002年1月14日正式發(fā)布了《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》及其附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》，衛(wèi)生部臨床檢驗中心也隨后發(fā)布了《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》等配套文件[6]。每個操作PCR實驗的工作人員,必須要具有相應理論知識及操作培訓合格證書,這也是確保實驗室避免污染的重要基礎。平時要注重實驗室管理，嚴格遵循實驗室的各項規(guī)章制度，積極參加相關知識培訓，努力提升業(yè)務能力。本院在 2005年申報了臨床基因擴增檢驗實驗室評審，是四川省衛(wèi)生廳頒發(fā)了評審合格證。這樣使基因擴增檢驗技術有效地應用于臨床，更好地為疾病的預防、診斷和治療服務，保證檢驗質量，才能使 PCR技術在科研和臨床工作中發(fā)揮更大的作用。

[1]朱忠勇.實用醫(yī)學檢驗學[M].2版.北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：1041.

[2] KwoK s,Higuchi R. Avoiding false positives with PCR[J].Na-ture,1989,339(2):223-238.

[3]林萬明,楊瑞馥,黃尚志.等.PCR技術操作和應用指南[M].第1版.北京:民軍醫(yī)出版社,1993:28-30.

[4] Or lando C.Developments in antiative PCR.Cl in.Chem Lab Med,1998,36:255-269.

[5]Whitcombe D.Advance in approaches to DNA based diagnostics.Curr Opin Biotechnol,1998,9:602-608.

[6]申子瑜，李金明.臨床基因擴增檢驗技術[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2002：176-186.

[7]李園,PCR實驗室的消毒與防污染措施[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2010.(7)3:285.

R 473.5

A

1672-5018（2017）03-257-01