一株高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的鑒定及產(chǎn)酯條件的研究

鐘姝霞，萬世旅，邊名鴻*，劉茗銘，楊贇，顏超

(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000；3.四川威斯特分析測(cè)試有限公司，四川成都610101）

一株高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的鑒定及產(chǎn)酯條件的研究

鐘姝霞1,2，萬世旅3，邊名鴻1,2*，劉茗銘1，楊贇1，顏超1

(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000；3.四川威斯特分析測(cè)試有限公司，四川成都610101）

以不同酒曲中篩選出的一株產(chǎn)乙酸乙酯能力較強(qiáng)的酵母Y2為研究對(duì)象，利用磷脂脂肪酸分析和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，通過單因素試驗(yàn)分別考察培養(yǎng)方式、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和糖化液糖度4個(gè)因素對(duì)酵母Y2產(chǎn)酯能力的影響，采用正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)酵母Y2的產(chǎn)酯條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，酵母Y2為異常畢赤酵母（Pichia anomala），其脂肪酸成分以18∶1ω9c為主；發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)酯量具有顯著性影響（P＜0.05），優(yōu)化后的產(chǎn)酯條件為：發(fā)酵溫度28℃，高粱糖化液糖度12°Bx，靜置培養(yǎng)5 d；在此最優(yōu)條件下，酵母Y2產(chǎn)乙酸乙酯的量可達(dá)到3.47 g/L。

酒曲；鑒定；異常畢赤酵母；乙酸乙酯；優(yōu)化

酯類物質(zhì)在白酒香氣形成過程中起到重要的作用，它既是香氣的組成成分，又是區(qū)別白酒與其他蒸餾酒不同的地方。產(chǎn)酯酵母是可生成較多量酯類物質(zhì)的酵母的通稱[1-2]，具有不同程度的酯化能力[3]。近幾年，對(duì)產(chǎn)酯酵母的研究愈加成熟[4-6]，余偉民等[4]采用在入窖前的糟醅中添加生香酵母的方法，考察添加后的酒體中總酯、四大乙酯等成分變化，其總酯、四大乙酯等均有較大的增幅，特香型白酒酒體風(fēng)格不變，酒體變得醇厚，酒質(zhì)得到了提高。

乙酸乙酯是我國白酒中含量較多的香味物質(zhì)之一，對(duì)白酒的風(fēng)格及成型具有重要的作用。乙酸乙酯是濃香型白酒四大骨架酯之一，也是清香型白酒的主體呈香呈味物質(zhì)[7]。但關(guān)于產(chǎn)酯酵母的代謝機(jī)理尚不清楚，相關(guān)報(bào)道較少。普遍認(rèn)為乙酸乙酯是在酵母細(xì)胞內(nèi)合成的，而不是在培養(yǎng)基中由酯化作用生成的，因此酵母菌健壯與否對(duì)酯的生成有著密切的關(guān)系。本試驗(yàn)以西南各地區(qū)的酒曲樣品中篩選出的一株高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌株Y2為研究對(duì)象，利用磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）分析和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化其產(chǎn)酯條件，以期能為小曲的制曲提供優(yōu)良的菌種，提高和穩(wěn)定小曲酒的風(fēng)味，改善酒質(zhì)，提高優(yōu)酒率。同時(shí)，促進(jìn)小曲酒的發(fā)展，提高小曲酒生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

從不同酒曲中篩選出的一株產(chǎn)乙酸乙酯能力較強(qiáng)的酵母Y2。

1.1.2 主要試劑

醋酸鈉、氯化鉀、無水乙醇、酚酞、氯仿、異戊醇、濃硫酸、濃鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；糖化酶（50000U/g）、淀粉酶（50000U/g）、蛋白胨、酵母浸膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇（色譜純）：德國Darmstadt公司；正己烷（色譜純）：美國Fisher Scientific公司；甲基叔丁醚（色譜純）：瑞典Telia公司；瓊脂糖：北京索萊寶科技有限公司；dNTPs、Taq DNA polymerase、TaKaRaTaqTM、DL2000TMDNA Marker：寶生物工程(大連)有限公司；真菌26S rDNA通用引物ITS1：TCCGTAGGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC：英濰捷基生物技術(shù)上海公司合成；十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、Tris-飽和酚、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，pH自然。

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，葡萄糖40.0 g/L，瓊脂15 g/L，pH值5.6±0.2。

發(fā)酵產(chǎn)酯培養(yǎng)基[8]：取150g高梁粉于2L燒杯中，加入少量自來水，攪成糊狀，再加80℃左右熱水600mL，攪勻。用體積分?jǐn)?shù)20%硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.5，加入80U/g α-淀粉酶于高粱液中，攪勻，置于75℃恒溫水浴鍋中液化30min，補(bǔ)足水至1200mL。將燒杯中的糖化液轉(zhuǎn)移到三角瓶中，高壓滅菌，待壓力升至0.1MPa后，保壓1 h，取出冷卻至60℃，用體積分?jǐn)?shù)20%硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，加入150 U/g糖化酶于高梁液中，然后放入60℃恒溫水浴鍋保溫糖化1h，煮沸5min。取出，室溫條件下5000r/min離心10min，取上清液備用。

1.2 儀器與設(shè)備

E100生物顯微成像系統(tǒng)：日本NIKON公司；6890N氣相色譜儀：美國Agilent科技有限公司；Sherlock 6.0微生物鑒定系統(tǒng)：美國MIDI公司；DM3000正置生物顯微鏡：德國徠卡公司；HT300A固相微萃取儀：意大利HTA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)酯酵母的磷脂脂肪酸分析

將活化好的酵母以四區(qū)劃線法接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)24h后提取磷脂脂肪酸。主要步驟為：挑取第三區(qū)的單菌落（約40mg）于有螺旋蓋的試管底部，加入1 mL皂化試劑（45 g氫氧化鈉溶于300mL體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液），擰緊螺蓋沸水浴5min，取出振蕩5～10 s，再度擰緊螺蓋，繼續(xù)沸水浴25 min；待樣品管冷卻后，加入2mL甲基化試劑（97.5mL濃鹽酸、137.5mL甲醇溶于65 mL蒸餾水），蓋嚴(yán)振蕩，（80±1）℃水浴10 min，冷水浴冷卻至25℃（溫度與時(shí)間要嚴(yán)格控制，以免羥基酸和環(huán)式脂肪酸受到破壞）；在冷卻的樣品管中加入1.25 mL甲基叔丁基醚，快速振蕩10 min，棄去下層水相；在剩余有機(jī)相中加入3 mL堿洗滌液（0.3 mol/L NaOH溶液），快速振蕩5 min，加3～4滴飽和氯化鈉溶液，取2/3上層有機(jī)相至氣相色譜樣品瓶中備用，用于氣相檢測(cè)。將待檢樣品于氣相色譜儀上機(jī)進(jìn)樣鑒定，氣相色譜各參數(shù)由MIDI Sherlock程序設(shè)置調(diào)用，將所得的磷脂脂肪酸信息與MIDI Sherlock中的YST28 3.80庫進(jìn)行比對(duì)，鑒定樣品中微生物的種類[9]。

1.3.2 產(chǎn)酯酵母的分子鑒定

采用改良的CTAB法[10]提取酵母Y2菌株DNA。

將提取的DNA送往上海杰李生物用真菌26S rDNA通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增并鑒定。

PCR擴(kuò)增體系（50μL）：ddH2O33.5μL，10×buffer5μL，dNTP 4 μL，引物各1 μL，模板5 μL，Taq0.5 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5.0 min；94℃變性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1.0 min）；30個(gè)循環(huán)72℃延伸7.0 min。

1.3.3 產(chǎn)酯條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

酵母Y2種子液制備：在無菌條件下挑取純菌種至100 mL菌種活化培養(yǎng)基，30℃、100 r/min培養(yǎng)72 h，得到酵母Y2種子液。

用高粱糖化液作為發(fā)酵培養(yǎng)基，將活化好的酵母種子液按10%（V/V）的接種量于發(fā)酵產(chǎn)酯培養(yǎng)基中，考察高粱糖化液糖度（6°Bx、8°Bx、10°Bx、12°Bx、14°Bx）、發(fā)酵溫度（22℃、25℃、28℃、31℃、34℃）、培養(yǎng)時(shí)間（2d、3d、4d、5d、6 d）和培養(yǎng)方式（搖床轉(zhuǎn)速50 r/min、100 r/min、150 r/min、靜置）4個(gè)因素對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯量的影響，確定較優(yōu)的產(chǎn)酯條件。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按L9（33）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]，考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、高粱糖化液糖度3個(gè)因素對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯量的影響，確定最佳產(chǎn)酯條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 酵母Y2發(fā)酵產(chǎn)酯條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for esterproducing conditions optimization of yeast Y2

1.3.5 乙酸乙酯含量的測(cè)定[12-14]

將發(fā)酵液用定性濾紙過濾除去菌體和沉淀，收集濾液后用0.45 μm微孔濾膜過濾，準(zhǔn)確量取過濾后的發(fā)酵液100 mL于蒸餾瓶中，并加入50 mL水蒸餾，收集100 mL餾出液，按GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中規(guī)定的方法測(cè)定餾出液中乙酸乙酯的含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（采用一般線性模型單因素Duncan法），檢測(cè)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所得數(shù)據(jù)在Origin 8.0中編輯作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酯酵母的磷脂脂肪酸分析

脂類物質(zhì)是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，且在細(xì)胞中含量穩(wěn)定[15-16]，約占細(xì)胞干質(zhì)量的5%[17]。通常這些脂類物質(zhì)的組成和含量在同一種微生物中是穩(wěn)定的和可遺傳的[18]。磷脂是一類含有磷酸的脂類物質(zhì)。磷脂脂肪酸即為甲基化脂類物質(zhì)并提取磷脂成分后，所得到的脂肪酸產(chǎn)物，它具有屬的特異性，通過磷脂脂肪酸的組成和含量的差異可對(duì)純種培養(yǎng)的微生物進(jìn)行快速鑒定。酵母Y2的磷脂脂肪酸分析和鑒定結(jié)果分別見表2、表3。由表2可知，酵母Y2的脂肪酸以長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸為主，其中含量最多的為18∶1ω9c（41.89%），該脂肪酸為真菌的一種標(biāo)志脂肪酸。由表3可知，通過與酵母庫YST28 3.80比對(duì)發(fā)現(xiàn)酵母Y2與第一選擇畢赤酵母（Pichia）相似值為0.331，與第二選擇Candida castrensis的相似值為0.214，說明酵母Y2可能為Pichia的一種非典型菌種[9]。

表2 酵母Y2的脂肪酸組成Table 2 Fatty acids composition of yeast Y2

表3 MIDI微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of MIDI microbial identification system

2.2 產(chǎn)酯酵母的分子鑒定

為進(jìn)一步確定酵母菌株Y2的種屬，利用引物ITS1和ITS4對(duì)酵母菌株Y2的26S rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增序列測(cè)序，用BLAST將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。由圖1可知，酵母菌株Y2與異常畢赤酵母（Pichia anomala）聚在一簇的相似度為100%，表明酵母菌株Y2屬于Pichia anomala。

圖1 菌株Y2的26S rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 26S rDNA-ITS sequence of yeast Y2

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同培養(yǎng)方式對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)酯的影響

考察培養(yǎng)方式對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酵母Y2產(chǎn)乙酸乙酯的影響Fig.2 Effects of different shaking table revolution on ethyl acetate production by yeast Y2

由圖2可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，乙酸乙酯產(chǎn)量呈明顯地下降趨勢(shì)（P＜0.05），而靜置培養(yǎng)的產(chǎn)酯能力明顯高于搖床培養(yǎng)，在此培養(yǎng)方式下，乙酸乙酯產(chǎn)量達(dá)到3.16 g/L，原因可能是由于通氣量過大使酵母呼吸旺盛，加速了乙酸乙酯的分解[1]。同時(shí)在空氣充足的條件下，酵母以生長(zhǎng)繁殖為主。由此可知，雖然產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯需要一定量的空氣，但不宜過多。因此，對(duì)酵母菌株Y2采用靜置培養(yǎng)。

2.3.2 高粱糖化液糖度對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)酯的影響

考察高粱糖化液糖度對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著糖化液糖度的增加，酵母Y2產(chǎn)乙酸乙酯量呈先增加后減少的趨勢(shì)，在糖化液糖度為10°Bx時(shí)產(chǎn)乙酸乙酯效果最佳，達(dá)到3.42 g/L。這說明一定范圍內(nèi)糖度增加對(duì)產(chǎn)酯有一定的促進(jìn)作用，但過后隨著糖度增加，其滲透壓增大，產(chǎn)酯量隨之下降。同時(shí)，高粱糖化液糖度為8°Bx、10°Bx和12°Bx時(shí)，其差異不顯著，因此選擇這三個(gè)糖度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 糖化液糖度對(duì)酵母Y2產(chǎn)乙酸乙酯的影響Fig.3 Effect of saccharification liquid sugar content on ethyl acetate production by yeast Y2

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酯的影響

考察發(fā)酵溫度對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)酵母Y2產(chǎn)乙酸乙酯的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on ethyl acetate production by yeast Y2

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯酯量呈先增加后降低，在發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，乙酸乙酯產(chǎn)量最高，達(dá)3.34 g/L。酵母酯化酶活力對(duì)溫度具有較高的依賴性，溫度的變化對(duì)酯化酶的作用有很大的影響。因此，選擇25℃、28℃和31℃進(jìn)行后面的正交試驗(yàn)。

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酯的影響

考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母Y2產(chǎn)乙酸乙酯的影響Fig.5 Effect of fermentation time on ethyl acetate production by yeast Y2

由圖5可知，酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯的量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加呈先增加后稍微降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵初期，酵母正處在生長(zhǎng)繁殖的高峰，乙酸乙酯合成量較少。隨后酯的合成旺盛，酯迅速積累，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)，乙酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為3.34 g/L；到第4天后趨于穩(wěn)定。其原因是酯的生成和分解是同時(shí)進(jìn)行的，4 d過后酯的分解速度加快。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間4 d為宜。

2.4 酵母菌株Y2產(chǎn)酯工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)酯發(fā)酵條件優(yōu)化，以乙酸乙酯的產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和高粱糖化液糖度3個(gè)因素，研究其對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)酯的影響，確定最佳的產(chǎn)酯工藝條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 酵母Y2發(fā)酵產(chǎn)酯條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for esterproducing conditions optimization of yeast Y2

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results

由表4可知，各影響因素對(duì)酵母Y2產(chǎn)酯的影響程度為RA＞RB＞RC，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞高粱糖化液糖度。綜合分析得到產(chǎn)酯最佳方案為A2B3C3，即發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間5 d，高粱糖化液糖度12°Bx。

由表5可知，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)酯具有顯著性影響（P＜0.05），高粱糖化液糖度對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)酯的影響不顯著（P＞0.05）。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)獲得酵母菌株Y2產(chǎn)酯的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度28℃，高粱糖化液糖度12°Bx，靜置培養(yǎng)5 d。在該優(yōu)化產(chǎn)酯條件下，通過3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯的量為3.47 g/L。

3 結(jié)論

本研究以酒曲中篩選得到一株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌株Y2為研究對(duì)象，經(jīng)PLFA和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，酵母菌株Y2為異常畢赤酵母（Pichia anomala），并采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了酵母菌株Y2最佳的產(chǎn)酯條件為發(fā)酵溫度28℃，高粱糖化液糖度12°Bx，靜置培養(yǎng)5 d。在此最優(yōu)產(chǎn)酯條件下，酵母菌株Y2產(chǎn)乙酸乙酯的量可達(dá)到3.47 g/L。在今后的研究中，可利用基因工程技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、誘變育種技術(shù)等高新技術(shù)來提高酵母的產(chǎn)酯能力，協(xié)調(diào)各香味物質(zhì)的比例，以達(dá)到理想的產(chǎn)香效果。

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Identification and ester-producing conditions of a high ethyl acetate-producing yeast

ZHONG Shuxia1,2,WAN Shilv3,BIAN Minghong1,2*,LIU Mingming1,YANG Yun1,YAN Chao1
(1.School of Biotechnology Engineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China;2.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China;3.Sichuan Swat Analyze and Test Limited Company,Chengdu 610101,China)

Using a high ethyl acetate-producing yeast strain Y2 screened from differentJiuquas research object,the yeast Y2 was identified by phospholipid fatty acid analysis and molecular biology methods.The effects of culture mode,fermentation time,fermentation temperature,and saccharification liquid sugar content on ester-producing ability of yeast Y2 were investigated by single factor experiment.The ester-producing conditions of yeast Y2 were optimized by orthogonal experiments and verification experiments.Results indicated that yeast Y2 wasPichia anomala, the main fatty acid composition was 18∶1ω9c,fermentation temperature and time had significant effect on ester yield of yeast Y2(P＜0.05).The optimum ester-producing conditions were as follows：fermentation temperature 28℃,sugar content of sorghum saccharification liquid 12°Bx,static culture for 5 d,in the optimum conditions,the ethyl acetate yield of yeast Y2 could reach 3.47 g/L.

Jiuqu;identification;Pichia anomala;ethyl acetate;optimization

TS261.1

0254-5071（2017）02-0075-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.016

2016-09-01

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（NJ2013-03）

鐘姝霞（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：邊名鴻（1979-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。