草莓果酒酵母菌的篩選、鑒定及耐受性研究

李豪，章霞，張靜，趙長青，趙興秀，鄒偉*

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

草莓果酒酵母菌的篩選、鑒定及耐受性研究

李豪，章霞，張靜，趙長青，趙興秀，鄒偉*

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

從自然發(fā)酵的草莓果酒中分離得到野生酵母菌，根據(jù)其菌落形態(tài)特征、生理生化實驗及酒精、二氧化硫、葡萄糖、pH的耐受性實驗，篩選出性能最優(yōu)2株菌株（RL4和RL6）進行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，初步鑒定菌株RL4和RL6分別為Hanseniaspora thailandica和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。該研究為草莓果酒研制提供了優(yōu)良酵母菌。

草莓果酒；篩選；發(fā)酵；酵母

草莓（Fragaria ananassaDuch）是薔薇科、草莓屬多年生草本，又名鳳梨草莓、紅莓、洋莓、地莓等，外觀呈心形，鮮美紅嫩，果肉多汁，含有特殊的濃郁水果芳香。草莓營養(yǎng)豐富，含有多種維生素（尤其是維生素C）、有機酸、氨基酸以及鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)和微量元素[1]。中國草莓種植面積達到9.01萬hm2，總產(chǎn)達220.6萬t，總產(chǎn)值達到200億元[2]。草莓是漿果，自然保鮮時間短，運輸與藏貯難，加之生產(chǎn)季節(jié)性較強，如在成熟高峰期鮮果不能很好銷售或儲藏，難免會導(dǎo)致價格大幅下降，損害種植戶利益[3]。因此，草莓深加工對于果農(nóng)增產(chǎn)增收具有重要意義。

將草莓加工成果酒可以很好地緩解產(chǎn)量過剩的問題，并且經(jīng)過發(fā)酵加工而成的果酒，其氨基酸含量更為豐富[4]。果酒能夠控制體內(nèi)膽固醇水平和促進血液循環(huán)，同時具有調(diào)節(jié)新陳代謝、美容養(yǎng)顏、抗衰老等作用[5-6]。目前草莓果酒的研究多集中在發(fā)酵工藝優(yōu)化、香氣成分檢測等方面，草莓果酒酵母篩選的研究還較少。草莓果酒釀造所用酵母多為通用型果酒酵母，不能滿足人們對于果酒多元化、風(fēng)格化的消費需求。呂慧威[7]通過草莓汁自然發(fā)酵篩選到一株發(fā)酵性能優(yōu)良的裂殖酵母屬菌株，吳浩等[8]通過生理生化試驗篩選到一株耐酸、發(fā)酵率高，并適合用于草莓釀造的釀酒酵母。本研究從草莓自然發(fā)酵的漿液中分離優(yōu)良菌株，對其進行形態(tài)特征、生理生化實驗及酒精、二氧化硫、葡萄糖、pH的耐受性實驗并對篩選出的性能優(yōu)良的菌株進行分子生物學(xué)鑒定，篩選出適合草莓果酒釀造的酵母菌，為草莓深加工奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

草莓采購于自貢市當(dāng)?shù)厮辏淦贩N為豐香草莓。

1.1.2 培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁，自然pH值，115℃滅菌15min。麥芽汁固體培養(yǎng)基：麥芽汁，瓊脂2%，自然pH值，115℃滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸出粉1%，蒸餾水1 000 mL，自然pH值，121℃滅菌20 min。YEPD固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加瓊脂2%。

碳同化培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.1%，酵母膏0.02%，碳源0.5%，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

氮同化培養(yǎng)基：葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.1%，酵母膏0.02%，水洗瓊脂2%，氮源0.5%，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

KH2PO4：天津市福晨化學(xué)試劑廠；MgSO4·7H2O：成都市科龍化工試劑廠；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨：成都金山化學(xué)試劑有限公司；DNA提取試劑盒：北京索萊寶公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

CFD-3120凝膠成像系統(tǒng)：上海山富科學(xué)儀器有限公司；H2-420型電熱恒溫水浴箱：鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司；phs-3型精密pH計：成都世紀方舟科技有限公司；Pi-Co21型臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；SKY-2102C型搖床：上海蘇坤實業(yè)有限公司；BH200普通光學(xué)顯微鏡：寧波舜余儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離與篩選

稱取約100 g成熟新鮮，無腐爛、無病蟲害的草莓，用榨汁機破碎后置于25℃條件下自然發(fā)酵48 h。將草莓發(fā)酵液用紗布過濾，取50 mL濾液，采用稀釋平板法，稀釋3倍得到150 mL稀釋液，取0.5 mL上述稀釋溶液在麥芽汁固體培養(yǎng)基上涂布，25℃條件下恒溫培養(yǎng)24～48 h。將得到的酵母菌株在YEPD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，用美蘭染色后在16×40倍顯微鏡下進行鏡檢，篩選出兩端出芽繁殖的菌株（酵母的無性繁殖為出芽繁殖）。將篩選出來的酵母菌株，再接種到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基中，28.5℃條件下培養(yǎng)3 d后，菌株菌落為淺黃色、不透明，表面為球形凸起、光滑，符合《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9]中的相關(guān)描述。

1.3.2 酵母菌的形態(tài)特征及生理生化鑒定[6-7]

形態(tài)與特征：將菌種接種到內(nèi)含杜氏管的YEPD液體培養(yǎng)基中，25℃條件下培養(yǎng)3～5 d，觀察杜氏管內(nèi)是否有氣泡、是否渾濁、試管底部是否成環(huán)或成島，并制水浸片于顯微鏡下觀察，觀察記錄酵母菌的無性繁殖方式及細胞形狀。

同化碳源：鑒定所需化合物共有7種，為葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、半乳糖、可溶性淀粉。將上述糖加入到含有杜氏管的氮源培養(yǎng)基中，糖含量為5%。將活化后的酵母菌接入到上述培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)1～2周，觀察試管是否渾濁并進行記錄。產(chǎn)生渾濁記為陽性（+），澄清記為陰性（-）。

同化氮源：鑒定所需化合物共有5種，為硝酸銨鈉、硫酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉、蛋白胨。將上述氮源加入到含有杜氏管的碳源培養(yǎng)基中，氮含量為5%。將活化后的酵母菌接入到上述培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)12周，觀察是否渾濁并進行記錄。渾濁記為陽性（+），澄清記為陰性（-）。

1.3.3 酵母菌的耐受性實驗[8-10]

酒精耐受性：將滅菌后的含有杜氏管的YEPD培養(yǎng)基，按4%、8%、12%、16%的體積分數(shù)加入乙醇，把活化后的酵母菌接入培養(yǎng)基中，篩選指標為在規(guī)定時間內(nèi)產(chǎn)氣泡大小。

SO2耐受性：將滅菌后的含有杜氏管的YEPD培養(yǎng)基，按100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L的質(zhì)量濃度加入SO2，以亞硫酸的形式加入[10]，活化后的酵母菌接入培養(yǎng)基中，篩選指標為在規(guī)定時間內(nèi)產(chǎn)氣泡大小。

低pH值耐受性：將滅菌后的含有杜氏管的YEPD培養(yǎng)基，用10 mol/L的鹽酸溶液將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為pH值分別是1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5的低pH值培養(yǎng)基，將活化后的酵母菌接入培養(yǎng)基中，篩選指標為在規(guī)定時間內(nèi)產(chǎn)氣泡大小。

葡萄糖耐受性：將滅菌后的含有杜氏管的YEPD培養(yǎng)基，按10%、20%、30%、40%、50%、60%的含量加入葡萄糖，活化后的酵母菌接入培養(yǎng)基中，篩選指標為在規(guī)定時間內(nèi)產(chǎn)氣泡大小。

1.3.4 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

菌株DNA的提取：將篩選菌株各取一環(huán)，接種于30 mL的YEPD液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為28.5℃，培養(yǎng)14 h，此時菌株處于對數(shù)生長期[11]。將培養(yǎng)出來的菌株使用試劑盒提取法提取基因組，實驗方法參照北京索萊寶公司的試劑盒提取說明書。將提取的基因組送由上海杰李生物有限公司完成18S rRNA序列擴增與測序。測序得到結(jié)果上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行基本的局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，下載同源性高的基因序列。將所有序列導(dǎo)入MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的篩選與鑒定

對分離出來的285株菌株進行YEPD培養(yǎng)，用美蘭染色后，在顯微鏡下進行鏡檢，最終篩選出以兩端出芽繁殖的菌株15株。將這15株接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基中，篩選出菌落為淺黃色，表面球形凸起、光滑、不透明的菌株，共6株，其形態(tài)特征及生理生化實驗結(jié)果分別見表1及表2。

由表1可知，6株酵母菌菌落均為乳白色，均為兩端出芽，均無假菌絲。菌株RL2、RL4、RL6為檸檬形，菌株RL1、RL5為球形，菌株RL3為卵形。菌株RL2、RL4、RL5、RL6沉淀緊實，產(chǎn)氣充滿杜氏小管，菌株RL1、RL3沉淀疏松，產(chǎn)氣達到杜氏小管體積的2/3。

由表2可知，6株菌均可以同化葡萄糖，半乳糖，果糖，麥芽糖，僅菌株RL1可以同化蔗糖，其余菌株均不能同化乳糖，蔗糖和可溶性淀粉；6株菌均可以同化硫酸銨，蛋白胨，除了菌株RL3可以同化硝酸鈉，其余均不能同化硝酸鉀、硝酸鈉和亞硝酸鈉。碳源、氮源同化結(jié)果與菌種鑒定手冊中的有孢漢遜酵母菌同化結(jié)果一致[12]。

表1 篩選酵母菌的形態(tài)特征Table 1 Morphology characteristics of yeasts screened

表2 篩選酵母菌的生理生化實驗結(jié)果Table 2 Results of physiology biochemistry experiments of yeasts screened

按照菌株形態(tài)及生理生化實驗結(jié)果，復(fù)篩4株酵母菌RL2、RL4、RL5、RL6進行耐受性實驗。

2.2 酵母菌株耐受性

將篩選出的菌株RL2、RL4、RL5、RL6活化后，進行酒精、SO2、低pH值、高濃度葡萄糖的耐受能力實驗，結(jié)果分別見表3～表6。

表3 篩選酵母菌的耐酒精能力實驗結(jié)果Table 3 Results of alcohol tolerance capacity experiments of yeasts screened

發(fā)酵果酒中酒精度通常為8%vol～17%vol[13]。過高的乙醇含量對酵母本身具有毒性，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和功能，能抑制酵母細胞的生長及繁殖能力，從而殺死酵母，因此要求生產(chǎn)中的酵母要具備一定的耐受酒精的能力[14]。由表3可知，所有酵母菌均耐受8%vol酒精，只有菌株RL4和RL6能耐受12%vol酒精，所有酵母菌均不耐受16%vol酒精。

表4 篩選酵母菌耐SO2能力實驗結(jié)果Table 4 Results of SO2tolerance capacity experiments of yeasts screened

果酒釀造中通常會添加50～250 mg/L SO2[12]，因此，選擇酵母菌的標準之一是能在較高SO2含量的果汁中進行酒精發(fā)酵。由表4可知，菌株RL2、RL4、RL6耐二氧化硫能力較強，均能耐受300 mg/L的SO2，菌株RL5耐二氧化硫能力較弱，不能耐受300 mg/L的SO2。

表5 篩選酵母菌耐低pH值能力實驗結(jié)果Table 5 Results of low pH tolerance capacity experiments of yeasts screened

pH對酵母代謝有很大的影響，能夠影響細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力及其生物酶活性[15]。由表5可知，所測試的菌株均能耐受pH值2.0，只有菌株RL4、RL6能耐受pH值1.5，菌株RL2、RL4、RL5、RL6均不耐受pH值1.0。

表6 篩選酵母菌耐高濃度葡萄糖能力實驗結(jié)果Table 6 Results of high concentration glucose tolerance capacity experiments of yeasts screened

由表6可知，酵母菌耐受40%的葡萄糖含量，只有菌株RL4、RL6能耐受50%的葡萄糖含量，所測試的菌株均不耐受60%葡萄糖含量。

綜上可知，菌株RL4和RL6耐酒精、耐SO2、耐酸及耐葡萄糖能力最強，因此選擇這兩株菌進行分子生物學(xué)鑒定。

2.3 酵母菌的分子學(xué)鑒定

對菌株RL4和RL6進行基因組提取并電泳檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株RL4和RL6在1 000～2 000 bp之間有明顯的電泳條帶。

圖1 菌株RL4及RL6基因組DNA提取結(jié)果的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of the genomic DNA of strains RL4 and RL6

將提取得到基因組序列送至上海杰李生物有限公司完成18S rRNA序列測序，得到序列后將基因上傳至NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對，選擇相似性高的序列下載其基因，將這些基因序列導(dǎo)入MEGA6.0軟件制作基因系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株RL4與RL6基于18S rRNA序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains RL4 and RL6 based on 18S rRNA sequence

由圖2可知，菌株RL4與Hanseniaspora thailandica親緣關(guān)系最近，序列相似度達到99%，菌株RL6與Hanseniaspora uvarum親緣關(guān)系最近，序列相似度為100%。初步鑒定菌株RL4、RL6分別為Hanseniaspora thailandica和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

3 結(jié)論

從草莓發(fā)酵液中最終分離得到6株酵母菌，對其進行形態(tài)特征及生理生化鑒定，復(fù)篩出4株菌株進行耐受性試驗，菌株RL4和RL6的耐受能力最好，能耐受12%vol的酒精、250 mg/L的SO2、pH值為1.5，50%葡萄糖。初步鑒定菌株RL4和RL6分別為Hanseniaspora thailandica和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。本研究為草莓果酒研制提供了優(yōu)良酵母菌。

[1]羅學(xué)兵，賀良明.草莓的營養(yǎng)價值與保健功能[J].中國食物與營養(yǎng)，2011，17（4）：74-76.

[2]張雯麗.中國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與前景思考[J].農(nóng)業(yè)展望，2012，8（2）：30-33.

[3]鐘正丹，趙長青，趙興秀，等.草莓深加工研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2015（6）：61-64.

[4]劉國明，石景財，陸云，等.草莓酒發(fā)酵菌種的篩選及工藝優(yōu)化[J].中國釀造，2016，35（9）：150-153.

[5]汪旭展.時尚桑果酒養(yǎng)顏又健康[J].大眾投資指南，2014（1）：43-44.

[6]吳茂玉，屈勤兵.果酒生產(chǎn)工藝研究進展[J].中國果菜，2010（9）：61. [7]呂慧威.草莓釀酒微生物及草莓酒發(fā)酵特性研究[D].大連：大連工業(yè)大學(xué)，2010.

[8]吳浩，可芮，宗亞丹，等.釀造草莓果酒的酵母菌株篩選及鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)信息，2013（21)：145-146.

[9]巴尼特，佩恩，亞羅，等.酵母菌的特征與鑒定手冊[M].胡瑞卿譯.青島：海洋大學(xué)出版社，1991：68-171.

[10]王玲，龐曉智.二氧化硫?qū)Σぬ}酒發(fā)酵過程及品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)，2010（4）：38-40.

[11]李秀萍，鄭平，吳幼茹，等.甘蔗酵母釀造果酒篩選及其發(fā)酵特性研究[J].中國釀造，2014，33（6）：63-66.

[12]史濤濤.云南德欽產(chǎn)區(qū)冰葡萄自然發(fā)酵過程中酵母的動態(tài)變化以及優(yōu)良釀酒酵母的篩選[D].濟南：齊魯工業(yè)大學(xué)，2013.

[13]中華人民共和國質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[14]王濱，張國政，路福平，等.酵母酒精耐性機制研究進展[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2001（1）：20-25.

[15]何珺珺，周如金，唐玉斌，等.響應(yīng)面法優(yōu)化荔枝渣發(fā)酵生產(chǎn)酒精的工藝條件[J].食品科學(xué)，2011，32（13）：254-258.

Screening,identification and tolerance research of the yeasts from strawberry wine

LI Hao,ZHANG Xia,ZHANG Jing,ZHAO Changqin,ZHAO Xingxiu,ZOU Wei*
(College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China)

Wild yeasts were screened and obtained from naturally fermented strawberry wine.According to colony morphology characteristics, physiological biochemical experiments and the tolerance experiments of alcohol,sulfur dioxide,glucose and pH,two strains(RL4 and RL6)with optimal performance were selected to identify the molecular biology.Results showed that strains RL4 and RL6 were preliminarily identified asHanseniaspora thailandicaandHanseniaspora uvarum,respectively,which provided excellent yeasts for development of strawberry wine.

strawberry wine;screening;fermentation;yeast

Q939.96

0254-5071（2017）02-0085-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.018

2016-09-26

四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510622054)；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室項目(NJ2015-11)；四川理工學(xué)院“瀘州老窖科研獎學(xué)金”項目(15ljzk09)

李豪（1992-），男，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵。

*通訊作者：鄒偉（1985-），男，講師，博士，研究方向為發(fā)酵與食品生物技術(shù)。