歐前胡素與異歐前胡素同牛血清白蛋白相互作用研究?

張宇潔，樊珊珊，張裕沛

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安710021)

藥物在進入人體內后會與體內的白蛋白發生不同程度結合，這種結合會延長藥物在體內的停留時間，但同時也會使藥物游離濃度減少，因此藥物與白蛋白的結合會改變藥物在體內的吸收、分布、代謝、排泄等過程。在臨床上容易與白蛋白結合的藥物，在體內的游離濃度較小，其代謝較慢，如果存在競爭結合作用的藥物，將會大幅度增加其游離濃度，進而可能發生毒副反應。當游離藥物在組織或血液中被代謝后，結合態藥物與白蛋白通過發生解離來提高血液中游離藥物的濃度，從而保證藥物的療效。因此出于對藥物的安全性、有效性的考慮，研究藥物與白蛋白作用具有非常重要的意義。

歐前胡素、異歐前胡素是同分異構體，都屬于6，7-呋喃香豆素類，均具有抗菌、抗炎、鎮痛、抗腫瘤、舒張血管活性等多種藥理活性[1-3]，目前有報道歐前胡素及異歐前胡素的藥代動力學研究[4-5]，但其與蛋白的作用尚未見報道。目前高效液相色譜與微透析技術聯用[6-9]，用于藥物與白蛋白的結合作用及藥物與蛋白的競爭結合研究較多。作者采用HPLC結合平衡透析法建立測定歐前胡素與異歐前胡素同牛血清白蛋白結合率的方法，為臨床合理用藥提供依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

歐前胡素對照品:批號14110724，異歐前胡素對照品:批號14110715，牛血清白蛋白:批號14081710，均為上海士鋒生物科技有限公司;甲醇:色譜純，其它試劑均為分析純，均為天津科密歐化學試劑有限公司。

高效液相色譜儀:DIONEX P680，紫外檢測器:DIONEX UVD170U，美國戴安;酸度計:E-201-9型，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對照品溶液

精密稱取歐前胡素與異歐前胡素對照品各10 mg，加甲醇溶解搖勻，制備成歐前胡素與異歐前胡素質量濃度為1.0 mg/m L的對照品，溶液于4℃冷藏備用。

1.2.2 牛血清白蛋白溶液

稱取牛血清白蛋白適量，用二次蒸餾水溶解制成質量濃度為40 mg/m L的溶液，置于4℃冰箱中，備用。

1.3 樣品的制備

分別精密量取異歐前胡素對照品溶液適量，加入袋外透析液中(透析液中加入0.005 g/m L的吐溫80作為增溶劑)，使透析外液的藥物質量濃度分別為100、200、300μg/m L。

1.4 透析袋前處理

將透析袋剪成約10 cm長的小段，用0.02 g/mL Na HCO3和1.0 mmol/L EDTA的混合液，將透析袋煮沸10 min，用蒸餾水徹底清洗后用30%乙醇浸泡，于4℃保存備用，臨用前再用蒸餾水將透析袋清洗干凈。

1.5 樣品的處理

取BSA 1.0 m L加至透析袋中，平行3份。將透析袋置于盛有20 m L含藥PBS液的比色管中，37℃水浴震蕩，透析至平衡，取透析平衡后的袋外透析液200μL，離心10 min，取上清液10μL進樣，測定袋外透析液中的歐前胡素和異歐前胡素藥物質量濃度，計算血漿蛋白結合率Fb＝(ρtρf)/ρt×100%。其中，Fb為藥物與蛋白的結合率;ρt為透析前透析液中藥物的總質量濃度;ρf為平衡時透析液中游離藥物的質量濃度。

1.6 色譜條件和系統適用性

色譜柱:250 mm×4.6 mm，5μm，流動相:V(甲醇)∶V(水)＝70∶30，流速:1 mL/min，檢測波長:280 nm，柱溫:27℃，進樣量:10μL，在此條件下測得歐前胡素與異歐前胡素的色譜圖，見圖1。

圖1 歐前胡素、異歐前胡素高效液相色譜圖

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線的繪制

分別精密量取不同質量濃度歐前胡素和異歐前胡素對照品溶液適量，用磷酸鹽緩沖液(p H＝7.4)稀釋，分別制成0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的系列質量濃度標準樣品，取10μL注入HPLC中，在擬定的色譜分析條件下檢測。以歐前胡素和異歐前胡素的質量濃度(mg/m L)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程如下。歐前胡素:y＝222.37x＋0.210 7，r＝0.999 9(n＝6)，歐前胡素的線性范圍0.01～0.4 mg/m L;異歐前胡素:y＝121.31x＋0.232 6，r＝0.999 8(n＝6)，異歐前胡素的線性范圍0.01～0.4 mg/m L。

2.1.2 精密度實驗

分別吸取歐前胡素和異歐前胡素對照品溶液，用磷酸鹽緩沖液(p H＝7.4)配制成1.0 mg/m L的溶液，連續進樣6次。計算歐前胡素和異歐前胡素的RSD值分別為0.5%和0.5%，

2.1.3 重復性實驗

取平衡透析后的歐前胡素和異歐前胡素樣品適量，連續進樣6次，計算歐前胡素與異歐前胡素峰的RSD值為1.3%、1.2%。

2.1.4 穩定性實驗

吸取歐前胡素和異歐前胡素對照品溶液，用磷酸鹽緩沖液(p H＝7.4)配制成1.0 mg/m L的溶液，37℃恒溫箱放置，分別在配制后4、8、12、18、24 h取樣測定，計算歐前胡素的RSD值為2.7%，異歐前胡素的RSD值為2.2%，表明在兩種成分在24 h內穩定性良好。

2.1.5 回收率實驗

吸取已知含量的同一質量濃度的樣品6份，分別加入歐前胡素與異歐前胡素對照品各10μg，透析平衡后取10μL注入HPLC中，計算回收率。歐前胡素與異歐前胡素的回收率分別為99.5%，98.9%。結果詳見表1。

表1 加樣回收率實驗結果(n＝6)

2.2 平衡透析結合HPLC實驗

2.2.1 結合率和結合常數的計算方法

透析袋臨用前在超純水中浸泡5 min，取含藥的20 m L透析液于比色管中，透析袋內加入BSA1.0 m L，透析袋扎緊后，放入上述比色管中。37℃恒溫箱放置，直至結合態藥物與游離態藥物處于動態平衡。藥物與蛋白的結合率計算方法與1.5相同。

2.2.2 透析平衡時間的確定

給透析袋內加入1 m L磷酸鹽緩沖液，將其放入含藥100μL和20 m L透析液的比色管中，使袋外的歐前胡素和異歐前胡素藥物濃度分別為300、200、100μg/m L，37℃水浴振蕩，分別于4、8、12、16、18、24 h測定藥物的質量濃度。結果表明在12 h已達到了平衡，因此優化平衡透析時間為12 h。

2.2.3 蛋白結合率測定結果

透析平衡后測定ρf，根據公式(1)，計算不同藥物濃度下的血漿蛋白結合率Fb。結果詳見表2。

表2 蛋白結合率測定結果(n＝3)

3 結 論

實驗結果表明，歐前胡素的蛋白結合率在79.3%，異歐前胡素的蛋白結合率約72.7%，蛋白結合率均較高，因此該藥物在臨床應用時受患者病理狀態或其它藥物合用的交互作用可能有一定的影響，所以，同服其它藥物時，應注意藥物間與血漿蛋白的競爭性結合。

歐前胡素與異歐前胡素屬于香豆素類化合物，難以溶于磷酸鹽緩沖液，作者采用0.005 g/m L的吐溫80作為增溶劑，由于時間問題未探討吐溫80是否對牛血清白蛋白產生影響，還有待進一步研究。

藥物與白蛋白的結合作用及藥物與蛋白的競爭結合研究除了高效液相色譜與微透析聯用的技術，還有采用超濾法與高效液相色譜聯用[10-11]，毛細管電泳法[12-13]，熒光光譜法[14]，紫外-可見分光光度法[15]等，每種方法各有特點，各方法之間的區別還有待進一步研究。

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