胚胎小鼠神經干細胞的培養和誘導分化

任麗伊，趙海霞，左 璇，李淑蓉，蘇炳銀△

1.成都醫學院 基礎醫學院 (成都 610500)；2.發育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)

·論 著·

胚胎小鼠神經干細胞的培養和誘導分化

*任麗伊1，趙海霞2，左 璇1，李淑蓉2，蘇炳銀2△

1.成都醫學院 基礎醫學院 (成都 610500)；2.發育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)

目的 探索體外培養和誘導分化胚胎小鼠神經干細胞(neural stem cells,NSCs)的方法。方法 分離12.5 d ICR小鼠胚胎的大腦皮質，通過Accutase酶消化法和機械消化法，將組織消化成單個細胞，置于完全培養基中培養，3 d后神經干細胞增殖成神經球；將傳代的神經球消化，通過誘導培養基誘導其分化；采用細胞免疫熒光染色和qRT-PCR技術檢測巢蛋白(Nestin)、中間微管相關蛋白2(Map2)和膠質纖維酸性蛋白(Gfap)的表達，鑒定NSCs、分化形成的神經元和星形膠質細胞。結果 NSCs能被Nestin特異性標記，誘導分化后的細胞可被Map2和Gfap抗體特異識別；qRT-PCR結果顯示，誘導后Nestin的表達水平降低，而Map2和Gfap的表達水平升高。 結論 通過Accutase酶消化法聯合機械消化法分離小鼠胚胎腦皮質，進行體外培養，可獲得具有自我更新能力和多向分化潛能的NSCs。

神經干細胞；神經元；星形膠質細胞；誘導分化

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是一類具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞潛能，并能增殖和自我更新，為腦組織提供大量細胞的細胞群[1]。它不僅存在于哺乳動物胚胎時期，在成體腦組織中也有分布。胚胎時期，NSCs在細胞微環境和各種因子共同作用下，可分化成不同類型的神經元和神經膠質細胞；成年腦組織中NSCs處于靜息狀態，損傷或疾病可以刺激潛在NSCs分化[2]。成體中NSCs作為一種后備貯存細胞，可參與神經系統損傷修復或細胞正常死亡的更新，補充因損傷、變性、衰老而喪失的神經元或膠質細胞，成為多種中樞神經系統疾病新的治療途徑[3]。

成年哺乳動物中樞神經系統損傷后，可激活分布于腦室下區(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回的顆粒細胞下層(subgranular zone，SGZ)的NSCs或神經祖細胞(neural progenitor cell，NPC)，招募到損傷部位進行神經再生修復，以彌補神經疾病導致的神經細胞缺失[4]。但此內源性的祖細胞招募和神經再生能力有限，人們開始尋求外源性NSCs移植治療中樞神經系統疾病的可能[5]。NSCs的體外培養為外源性NSCs移植提供了重要的細胞來源。

本實驗通過分離胚胎期小鼠大腦皮質進行體外培養，篩選出具有NSCs特性的體外細胞群，旨在提供一種從小鼠胚胎中獲取NSCs的方法，豐富體外培養NSCs技術，為NSCs移植研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

ICR小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司；DMEM/F12(1∶1)培養基、青霉素-鏈霉素溶液、Lipofectamine 2000、Trizol購自美國Invitrogen公司；堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)購自美國PeproTech公司；小鼠單克隆抗體Nestin和Map2、抗兔多克隆抗體Gfap購自美國Sigma公司產品。儀器：倒置熒光顯微鏡(Olympus CKX41)、冷凍離心機(美國Thermo公司)、實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、CO2恒溫培養箱(美國Bio-Rad公司)、體視顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 NSCs的分離培養和誘導分化

收集12.5 d胚胎小鼠的皮質，切成小碎塊，置于DMEM/F 12中，用槍頭輕輕吹散，1 000 rpm離心5 min,去上清后加入適量Accutase酶重懸，消化5～10 min，消化時用槍頭輕輕吹打，直至組織消化成單細胞。經200目的細胞篩濾過，收集過濾后細胞液，再次以1 000 rpm離心5 min，去上清。加入1 mL完全培養基(配方：DMEM/F 12、B 27(終濃度2%)、青霉素-鏈霉素溶液(1%)、GlutaMax(1%)、肝素(2 μg/mL)、bFGF(20 ng/mL)、EGF(20 ng/mL))重懸細胞沉淀，輕吹混勻后統計細胞數量，將細胞以2×105cells/mL的密度接種到加完全培養基的100 mm培養皿中。37 ℃、5%CO2孵箱培養，2～3 d半量換液1次，5～7 d后收集增殖而成的神經球，將其消化成單個細胞，以上述相同的密度接種到新鮮的完全培養基中傳代培養[6]。

準備一個用多聚賴氨酸包被處理過的24孔板，細胞傳代2次后，將其培養成神經球，收集大量神經球，用Accutase酶消化，機械輕輕吹打成單個細胞，細胞計數后以2×105cells/mL 的密度接種到24孔板中，加入適量分化培養基(DMEM/F 12、B 27(終濃度2%)、青霉素-鏈霉素溶液(1%)、GlutaMax(1%)、肝素(2 μg/mL)、10%胎牛血清)，置于培養箱中貼壁培養3 d或7 d[6]。

1.3 細胞免疫熒光技術

對貼壁培養的細胞進行免疫熒光染色以檢測細胞內特異抗原。先吸盡孔中培養液，用4%多聚甲醛(PFA)室溫固40 min，吸出，洗滌。加透化性封閉液(10%血清配制)室溫封閉1 h；加入抗體Anti-Nestin、Anti-Map2或Anti-Gfap配制的一抗稀釋液(濃度1∶200)，4 ℃過夜。吸出一抗，洗滌。加入相應熒光二抗稀釋液(濃度1∶200)，常溫孵育2 h；吸出，洗滌。加入DAPI細胞核染劑后，用PBS配制的50%甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照[7]。

1.4 qRT-PCR技術

將傳代的NSCs以2×105cells/mL的密度接種到多聚賴氨酸包被的6孔板中，加誘導培養基，誘導分化3 d或7 d。收集細胞，用Trizol法提取總RNA，使用cDNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。以此cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達量[7]。引物序列為：Nestin上游：5′-CGGGAGAGTCGCTTAGAGGT-3′，下游5′-AGACCCTGCTTCTCCTGCTC-3′；Sox2上游：5′-CATGCACCGCTACGACGTGAG-3′，下游：5′-TGGGAGGAAGAGGTAACCACAGG-3′；Map2上游：5′-GTCACAGGGCACCTATTC-3′，下游：5′-CACCTTTCAGGACTGCTAC-3′；Gfap上游：5′-ACCCTGGCTCGTGTGGAT-3′，下游：5′-GCCACATCCATCTCCACG-3′；Gapdh上游：5′-GAAACCTGCCAAGTATGATGACA-3′，下游：5′-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAGA-3′。

1.5 細胞測量和計數

使用圖像處理分析軟件Image-Pro Plus(IPP)進行神經球的直徑測量；將圖片導入Photoshop圖像處理軟件，對細胞數量進行手動精確計數。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 NSCs的原代和傳代培養

分離12.5 d ICR胚胎小鼠腦皮質，將其消化為單個細胞進行體外培養。在顯微鏡下相差觀察2、4 、6 d細胞生長情況(圖1A-C)，原代NSCs由單個細胞增殖分裂，逐漸形成直徑約100 μM的神經球。在培養過程中細胞有絲分裂導致細胞數量增多，神經球變大。傳代后，鏡下觀察相同生長時段的細胞(圖1D-F)，相較原代細胞傳代后的細胞折光度更強，神經球形狀更規整，細胞緊密度更高；鏡下所見相同生長時段，傳代細胞形成的神經球大部分比原代神經球小。

圖1 體外培養的NSCs形態

用IPP軟件測量不同時段原代和傳代的神經細胞球直徑(圖2)，可見：原代和傳代的神經球直徑都隨時間增大，細胞數穩定增多。無論是原代細胞還是傳代細胞，生長6 d的神經球直徑都較4 d明顯增大，差異有統計學意義(P<0.001)。傳代神經球變化趨勢與原代神經球大致相同，但比較發現，傳代神經球生長到第6天時，直徑明顯小于同時段的原代神經球，差異有統計學意義(P<0.001 )。

圖2 生長不同時間段的神經球直徑比較

2.2 巢蛋白Nestin鑒定NSCs

已知Nestin是NSCs特異性標記物，本實驗采用細胞免疫熒光技術，對傳代神經球進行標記。染色后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，見神經球被Anti-Nestin抗體標記，顯紅色熒光，與DAPI藍染的細胞核合成后，如圖3(Merge)所示。由此可鑒定神經球由NSCs聚合形成。

2.3 檢測NSCs分化后3 d和7 d后的細胞類型

NSCs能分化成3種神經細胞:神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞[8]。就比例而言，NSCs大部分分化成神經元和星形膠質細胞，極少數分化為少突膠質細胞[9]。本實驗針對前2種細胞類型，進行細胞免疫熒光檢測，鑒別細胞類型。在血清分化培養基的誘導下，NSCs分化情況如圖4所示，貼壁的NSCs分化成神經元可被Map2標記，鏡下胞質顯紅色熒光，成熟的神經元突起為拖尾的彗星狀(白箭頭)，有些突起上出現分支；分化成星形膠質細胞可被Gfap標記，胞質呈現綠色熒光，星形膠質細胞胞質豐富，細胞形態似梭形或多爪形；細胞核被DAPI標記呈藍色。

圖3 細胞免疫熒光技術鑒定神經球

圖4 血清誘導NSCs分化IHC

圖5 分化不同時段細胞的數量統計

誘導分化3 d和7 d所形成的細胞比例不同，統計結果如圖5所示。在血清誘導下，被Map2標記的神經元數量隨著分化時間3～7 d，數量先增多后變少，而Gfap標記的星形膠質細胞數目從分化3～7 d呈明顯增長趨勢；其他未標記細胞數卻由多變少，差異有統計學意義(P<0.001)。誘導NSCs分化過程中，分化3 d時，可見部分細胞分化，可朝神經元和星形膠質細胞方向分化；分化7 d后，參與分化的細胞數量增加，而朝星形膠質細胞方向分化的細胞增多，朝神經元方向分化的細胞減少。

2.4 檢測分化3 d和7 d的NSCs相關基因的表達

提取血清誘導下NSCs分化3 d和7 d的細胞總RNA，反轉錄成cDNA進行qRT-PCR實驗，檢測NSCs分化時期相關基因的表達。Nestin是NSCs的經典標記物，轉錄因子Sox2是NSCs的核心轉錄因子之一，也可作為NSCs的標記物。實驗中發現，二者mRNA表達量均隨分化時間的延長而降低，說明分化細胞中，Nestin和Sox2表達量隨時間而減少(圖6A，6B)。神經元標記物Map2的表達水平在分化過程中也有變化，在分化3 d時明顯升高，分化7 d后Map2的表達量明顯降低(圖6C)，表明本實驗中NSCs朝神經元方向分化主要在誘導分化前期。另外，代表星形膠質細胞的Gfap基因表達水平從誘導分化開始到3 d和7 d處于持續升高狀態，差異具有統計學意義(P<0.001)。由此可見，血清誘導NSCs分化過程中，NSCs相關基因表達量呈降低趨勢，而代表分化細胞的兩種基因表達水平隨分化時間明顯升高。

圖6 qRT-PCR顯示NSCs誘導分化基因的表達

3 討論

自NSCs的無限增殖能力和多向分化潛能特性被揭示后，人們對其在中樞神經系統損傷和退行性疾病中可能發揮的治療作用充滿期望。大量研究[10]發現，NSCs在神經再生和損傷修復中發揮重要作用，可修復和代替受損神經組織，重建部分環路，幫助恢復其生物學功能。目前，動物模型上移植NSCs用于治療帕金森病、腦膠質瘤、阿爾茨海默病、脊髓損傷等疾病已取得一定的成效[11]。NSCs移植是治療中樞神經系統損傷、退行性病變和神經元缺失導致的神經系統疾病的重要方法[12]。但是，NSCs移植治療在人體中的應用仍受限于細胞來源與不成熟的體外穩定培養擴增技術[13]。外源性NSCs大部分來自活體腦組織中NSCs的分離培養。哺乳動物胚胎期，NSCs主要分布在大腦的皮層、紋狀體、海馬、室管膜下層和中腦等區域；成年后，中樞神經系統中存在靜止狀態的NSCs，其分布主要局限在海馬齒狀回、紋狀體和雙側腦室下區[2]。

不同來源背景的NSCs干性維持情況和基因修飾等不同，用于移植治療的效果也有差異[14]。據報道，NSCs于胚胎12 d開始出現，15 d達高峰，因此，本實驗提取的NSCs來源于12.5 d胚胎大腦皮質，此發育階段的NSCs干性維持較好，在皮質中分布較廣[15]。分離這個時期的皮質，消化后進行體外培養，細胞分裂能力強，5～7 d就能形成直徑約100 μM的神經球，且形成的神經球能被Nestin鑒別。實驗中選用溫和的Accutase酶消化組織和神經球，其間配合移液槍輕柔的吹打混勻，此方法相較于其他實驗利用胰酶消化或直接機械消化法，可以減少消化酶和單純的機械吹打對細胞的損傷[16]。此外，在NSCs成球過程中，神經球中間的細胞堆積，養分供給不足，導致中間細胞狀態較差，所以在神經球直徑>100 μM前及時傳代，能很好的提高傳代細胞的活力，使傳代神經球折光度更高，細胞狀態更好。最后，本實驗培養的NSCs分化潛能也得到了驗證。在培養基中添加血清，誘導貼壁的NSCs分化3 d，能形成可被Map2標記的神經元，也能分化成被Gfap標記的星形膠質細胞，分化到第7天時，NSCs大量分化成星形膠質細胞，此時還有少量分化成神經元，這一結果與已發表的文獻所述相符[17]。本實驗不僅通過細胞免疫熒光實驗證實了NSCs分化成神經元和星形膠質細胞，qRT-PCR檢測也顯示了同樣的結果。檢測分化0、3、7 d相關基因的表達水平，結果發現，NSCs標記分子Nestin和Sox2的表達水平在分化過程中呈降低趨勢；分別代表神經元的標記分子Map2和星形膠質細胞的標記分子Gfap分化3 d均有明顯升高，但是分化7 d時Map2表達量降低，而Gfap仍然持續升高，結果與免疫熒光染色后細胞計數結果一致。

綜上所述，本實驗所提供的NSCs培養方法，成功地從12.5 d ICR胚鼠大腦皮質中分離出細胞，體外培養，獲得了具有增殖能力和分化潛能的NSCs。作為一種NSCs體外培養方法，本研究對于外源性NSCs的獲取具有重要的意義。

[1]Gage F H. Mammalian neural stem cells[J]. Science, 2000, 287(5457): 1433-1438.

[2]Temple S. The development of neural stem cells[J]. Nature, 2001, 414(6859): 112-117.

[3]Wennersten A, Meier X, Holmin S,etal. Proliferation, migration, and differentiation of human neural stem/progenitor cells after transplantation into a rat model of traumatic brain injury[J]. J Neurosurg, 2004, 100(1): 88-96.

[4]Bond A M, Ming G L, Song H. Adult Mammalian Neural Stem Cells and Neurogenesis: Five Decades Later[J]. Cell Stem Cell, 2015, 17(4): 385-395.

[5]Zizkova M, Sucha R, Tyleckova J,etal. Proteome-wide analysis of neural stem cell differentiation to facilitate transition to cell replacement therapies[J]. Expert Rev Proteomics, 2015, 12(1): 83-95.

[6]Hosseini S M, Sharafkhah A, Koohi-Hosseinabadi O,etal. Transplantation of Neural Stem Cells Cultured in Alginate Scaffold for Spinal Cord Injury in Rats[J]. Asian Spine J, 2016, 10(4): 611-618.

[7]趙祥宇, 舒鵬程, 張靖, 等. 小鼠腦皮質神經干細胞體外培養及miRNAs影響其分化能力[J]. 基礎醫學與臨床, 2011, 31(6): 630-635.

[8]Song H, Stevens C F, Gage F H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells[J]. Nature, 2002, 417(6884): 39-44.

[9]Reynolds B A, Weiss S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell[J]. Dev Biol, 1996, 175(1): 1-13.

[10] De Feo D, Merlini A, Laterza C,etal. Neural stem cell transplantation in central nervous system disorders: from cell replacement to neuroprotection[J]. Curr Opin Neurol, 2012, 25(3): 322-333.

[11] Srinageshwar B, Maiti P, Dunbar G L,etal. Role of Epigenetics in Stem Cell Proliferation and Differentiation: Implications for Treating Neurodegenerative Diseases[J]. Int J Mol Sci, 2016,17(2):199.

[12] 錢曉丹, 羅春霞, 朱東亞. 神經干細胞移植研究進展[J]. 中國細胞生物學學報, 2012, 34(3): 212-217.

[13] 高海霞, 金華君, 錢其軍. 神經干細胞的干性維持機制[J]. 中國組織工程研究, 2012, 16(19): 3593-3597.

[14] Piltti K M, Salazar D L, Uchida N,etal. Safety of human neural stem cell transplantation in chronic spinal cord injury[J]. Stem Cells Transl Med, 2013, 2(12): 961-974.

[15] Louis S A, Mak C K, Reynolds B A. Methods to culture, differentiate, and characterize neural stem cells from the adult and embryonic mouse central nervous system [J]. Methods Mol Biol, 2013,946:479-506.

[16] 鐘德君, 張德盛, 宋躍明. 鼠胚神經干細胞體外培養方法的優化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2007, 11(50): 10088-10092.

[17] Horner P J, Power A E, Kempermann G,etal. Proliferation and differentiation of progenitor cells throughout the intact adult rat spinal cord[J]. J Neurosci, 2000, 20(6): 2218-2228.

The Culture and Induced Differentiation of Neural Stem Cells of Embryonic Mice

RenLiyi1,ZhaoHaixia2,ZuoXuan1,LiShurong2,SuBingyin2△.

1.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SichuanKeyLaboratoryofDevelopmentandRegeneration,Chengdu610500,China

Objective To explore the method of culture and induced differentiation of neural stem cells in vitro. Methods The neural stem cells were isolated from the cerebral cortex of 12.5-day mouse embryo and digested into single cells by the Accutase enzyme digestion method and mechanical percussion. The single cells were cultured in complete medium. After 3 days, the neural stem cells proliferated into neurospheres. The subcultured neurospheres were digested and differentiated by induced medium. The methods of immunofluorescence staining and qRT-PCR were adopted to assay the expression levels of Nestin, microtubule-associated protein 2 (Map2), and glial fibrillary acidic protein (Gfap) and identify the neural stem cells and the neurons and astrocytes differentiated from the neural stem cells. Results The cultured neural stem cells were marked by Nestin specific markers; the cells induced from the neural stem cells could be identified by anti-Map2 or anti-Gfap specific antibody. According to the results of qRT-PCR, the expression level of Nestin decreased, while the expression levels ofMap2 and Gfap increased. Conclusion The Accutase enzyme digestion method combined with the mechanical percussion can separate the cells from the cerebral cortex of embryonic mouse and those cells can be cultured in vitro to obtain the neural stem cells with the capability of self-renewal and multi-directional differentiation potential.

Neural stem cells; Neuron; Astrocyte; Induced differentiation

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170220.1138.012.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.001

國家自然科學基金資助項目(No:31600973)；發育與再生四川省重點實驗室基金資助項目(No:SYS14-003)；四川省教育廳科研基金資助項目(No:16ZA0278)；成都醫學院校基金資助項目(No:CYZ14-004)

R329.2

A

△通信作者：蘇炳銀，E-mail：subingyinn@163.com