柴芩承氣湯對急性胰腺炎大鼠肺泡巨噬細胞PERK基因表達的影響

王昊陽，郭 佳，駱瑞杰，夏 慶，薛 平

四川大學華西醫院 中西醫結合科(成都 610041 )

柴芩承氣湯對急性胰腺炎大鼠肺泡巨噬細胞PERK基因表達的影響

*王昊陽，郭 佳，駱瑞杰，夏 慶，薛 平△

四川大學華西醫院 中西醫結合科(成都 610041 )

目的 探討柴芩承氣湯(Chai Qin Cheng Qi decoction，CQCQD)對急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)大鼠肺泡巨噬細胞內質網雙鏈RNA 依賴蛋白激酶樣ER激酶(PKR-like ER kinase, PERK)mRNA表達的影響。方法 將30只SD大鼠隨機分成對照組、AP組及CQCQD組(n=10)。AP組采用20%L-精氨酸腹腔注射(2.5 g·kg-1·1h-1×2)制作；CQCQD組分別于第0、2、4 h 用CQCQD按0.2 mL/100 g灌胃，對照組采用生理鹽水代替CQCQD灌胃，容積及方法與CQCQD組同。于6 h收集胰腺組織行病理檢查，肺泡巨噬細胞檢測PERK的mRNA表達，血清檢測大鼠血清IL-6及TNF-α水平。結果 AP組胰腺組織病理評分(8.8±0.5)分，高于對照組(1.0±0.3)分及CQCQD組(5.4±0.6)分(P<0.05)；CQCQD組血清IL-6及TNF-α(48.3±10.7 pg/mL，35.1±14.5 pg/mL)高于對照組(35.1±10.6 pg/mL，21.3±14.2 pg/mL，P<0.05)，但低于AP組血清(67.5±13.1 pg/mL，52.1±13.7 pg/mL，P<0.05)。與對照組比較，AP組巨噬細胞PERK mRNA表達上調，CQCQD灌胃可下調其表達(P<0.05)。結論 CQCQD減少炎性因子釋放可能與下調巨噬細胞內質網PERK mRNA表達有關。

柴芩承氣湯； 雙鏈RNA 依賴蛋白激酶樣ER激酶； 急性胰腺炎； 巨噬細胞

全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)不但是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)早期重要的病理生理特征，還是導致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的主要原因之一[1]。減少促炎因子釋放可緩解SIRS。作用于膽堿能抗炎通路可在轉錄后蛋白合成水平減少巨噬細胞釋放促炎因子，但機制尚不明了。近年的研究[2]已證實，當mRNA翻譯增多時，可激活內質網肌醇需酶(inositol requiring enzyme 1α，IRE1α)、激活作用轉錄因子(activating transcription factor 6, ATF6) 及雙鏈RNA 依賴的蛋白激酶樣ER 激酶(PKR-like ER kinase, PERK)所介導的3條內質網未折疊蛋白響應信號通路，增強內質網的蛋白加工處理能力。我們前期研究已經證實柴芩承氣湯(Chai Qin Cheng Qi decoction，CQCQD)可減少急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)患者血清促炎因子水平。新近研究[3-4]發現，CQCQD作用于膽堿能抗炎通路能夠上調AP巨噬細胞煙堿型乙酰膽堿受體α7(nicotinic acetylcholine receptor α7, nAChRα7)及IRE1的表達，減少AP炎性介質釋放，緩解AP胰腺病理損害[3]，但對PERK是否有影響，目前尚無研究。因此，本研究擬采用動物實驗，探討CQCQD對AP大鼠肺泡巨噬細胞PERK mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體質量250～300 g 的SD雄性健康成年大鼠，由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。

1.2 藥物

CQCQD組成[4]: 柴胡15 g，黃芩15 g，厚樸15 g，枳實15 g，茵陳15 g，梔子20 g，大黃20 g( 后下)，芒硝20 g ( 沖服)。將中藥用清水500 mL浸泡1 h，然后用煎藥機煎0.5 h，煎出藥液200 mL。由四川大學華西醫學中心生化教研室制作成凍干粉。實驗前用注射用水按3.0 g/mL生藥配制備用。

1.3 試劑

L-精氨酸(BCB09906V，Sigma，美國)；Trizol購至美國invitrogen公司(批號：50563209)；Taq DNA PCR反應試劑盒由TAKARA大連寶生生產(批號：ck3501AA)；dNTP購至美國普洛麥格(Promega)公司(批號：251230)；逆轉錄試劑盒購至EU Fermentas 公司(批號：00098448)；DNA分子量標準(DNA Marker)購至北京康為世紀公司(批號：16911K)；電泳級瓊脂糖購至GENE TECH上海有限公司(批號：111760)；其他實驗室常備試劑均為國產分析純。測序：上海生工生物工程有限公司；引物設計網站：www.ncbi.nlm.nih.gov。

1.4 儀器

FTC2000實時熒光定量基因擴增儀為加拿大楓嶺(FUNGLYN)公司生產；MSE Micro-Centaur Centrifuge微型臺式離心機為日本Sanyo公司生產；水平電泳儀(MODEL 200/2.0，BIO-RAD，USA)；水平離心機LD5-2A為北京醫用離心機廠生產；Gel Doc 1000 凝膠成像系統(Gel Doc,BIO-RAD，USA)；其他實驗室常備器皿、耗材均為國產優質品。

1.5 AP模型制作

實驗前，大鼠適應性喂養7 d，造模前禁食12 h，但不禁水。AP模型采用20%的L-精氨酸2.5 g/kg腹腔注射，1 h后再次注射相同劑量L-精氨酸，24 h后造模成功；假模型采用相同溶劑的生理鹽水代替L-精氨酸，給藥劑量及方法與AP模型同。

1.6 分組及標本收集

采用數字隨機法，將30只健康成年SD大鼠隨機分成對照組、AP組及CQCQD組(n=10)。AP組及CQCQD組采用AP模型，對照組采用假模型。造模成功后，CQCQD組分別于0、2、4 h用CQCQD按0.2 mL/100 g灌胃；AP組及對照組采用生理鹽水代替CQCQD，于6 h從大鼠心臟采血，分離血清，檢測IL-6及TNF-α；分離肺巨噬細胞檢測PERK的mRNA表達變化；同時取胰腺組織進行病理評分。

1.7 肺泡巨噬細胞收集

采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定大鼠，艾利克消毒，延胸骨剪開胸腔，取右肺下葉，尋及氣管，插入管喂器并固定，注入PBS液5～8 mL，快速反復抽吸10次后，收集肺泡灌洗液；將獲得的肺泡灌洗液以800 r/min離心10 min，去上清，再加入PBS液10 mL，用移液槍吹打混勻，再以800 r/min離心10 min，去上清，獲得肺泡巨噬細胞，備用。

1.8 肺巨噬細胞內質網PERK的mRNA檢測

灌胃6 h 后，取大鼠右下肺收集巨噬細胞?？俁NA提取采用Trizol 試劑2 mL冰上提?。凰锰结?、內參基因及引物均購至上海生物科技有限公司。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因作為內參基因( β-actin) ，測PERK的mRNA。PERK探針:5′-CGC AGGCTTTTCCATCCTC-3′; 上游引物:5′- CTG CACTGGTGGAAGGAAAT-3′; 下游引物:5′-CA CTGAGTTTCAGACTCCTT -3′。β-Actin 探針: 5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGA-3′; 上游引物: 5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT3′; 下游引物: 5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。共進行45個循環的擴增反應，反應完成后，系統將采集到的每一循環反應時的各反應管的熒光強度增長指數(DRn)進行分析，繪制擴增動力學曲線，從而獲得某特定閾值時的擴增循環數(Ct 值)。

1.9 血清 IL-6及TNF-α檢測

各組血清IL-6及TNF-α采用ELISA 試劑盒檢測，具體操作步驟按試劑盒說明進行。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 各組胰腺病理評分比較

AP組胰腺組織病理評分(8.8±0.5)分，高于對照組(1.0±0.3)分及CQCQD組(5.4±0.6)分(P<0.05)。

2.2 各組血清炎性因子水平比較

CQCQD組血清IL-6及TNF-α水平高于對照組，但低于AP組(P<0.05)(表1)。

表1 各組血清IL-6及TNF-α比較

注：與對照組及CQCQD組比較，aP<0.05; 與對照組及AP組比較，bP<0.05

2.3 PERK mRNA表達

3組內參基因β-actin的Ct值比較差異無統計學意義 (P>0.05)；但AP組PERK基因的Ct值低于對照組和CQCQD組(P<0.05)。提示AP組PERK mRNA表達相對于對照組上升，CQCQD可下調PERK mRNA表達(表2)。

表2 各組PERK及β-actin mRNA的Ct值比較

注：與對照組及CQCQD組比較,aP<0.05； 與AP組相比較，bP<0.05

3 討論

隨著對SAP急性期SIRS發病機制研究的深入，以及臨床救治技術水平不斷提高，SAP急性期SIRS的治療效果有了一定改善，但西醫TNF-α抗體等單純的抗炎治療，仍未能取得理想的臨床療效，遇到了不能及時緩解SIRS的瓶頸。近年來，國內在西醫治療的基礎上，采用大承氣湯加減化裁而來的CQCQD、清胰湯等中藥湯劑治療SAP取得了很好的臨床療效，基礎研究亦取得了一定進展，也逐漸得到國內外學者的認可，但對其療效機制尚未完全明了。

CQCQD是四川大學華西醫院中西醫結合治療SAP急性期療效確切的臨床驗方[5]。該方由大承氣湯加減化裁而來。其有效成分是生大黃、芒硝、枳實、厚樸、梔子、茵陳蒿、柴胡和黃芩。其中大黃具有抑制酶活性、抗菌、通便和解除膽道oddi括約肌痙攣的作用,且具有活血化瘀、改善微循環、清除位于胃腸道內細菌與毒素,以及改善胃腸黏膜血液循環的功效[8]。同時，大黃也能夠降低嚴重創傷、休克和感染等患者應激性腸黏膜病變、多器官功能失調綜合征的發病率,可以顯著降低多器官功失調綜合征患者血漿TNF-α和內毒素含量, 顯著提高SAP的治愈率[9]。厚樸中含厚樸酚, 有治療實熱內蘊、腑氣不通之功效；芒硝咸寒潤下、瀉熱通里,有利黃疸消退[10]。枳實可行氣消痞；梔子有除煩瀉火,清熱利尿,涼血解毒,散瘀血的作用；茵陳蒿清熱利濕；柴胡和解少陽；黃芩瀉實火，除、濕熱，止血安胎[11]。

膽堿能抗炎通路中，減少巨噬細胞促炎因子釋放的作用靶點是轉錄后水平。我們近年來的研究重點是CQCQD對巨噬細胞內質網功能的影響。課題組前期研究[6]已經證實，CQCQD可下調巨噬細胞內質網IRE1表達，減少促炎因子釋放，但是否同時也作用于PERK介導的通路，尚未研究。本研究發現，L-精氨酸誘導的AP大鼠肺泡巨噬細胞PERK mRNA表達上調，血清IL-6及TNF-α水平升高(P<0.05)；管喂CQCQD后，AP大鼠肺泡巨噬細胞PERK mRNA表達下調，且血清IL-6及TNF-α水平和胰腺病理評分也較AP組明顯降低(P<0.05)。提示AP血清促炎因子升高可能與巨噬細胞存在PERK mRNA表達上調有關；CQCQD降低鼠血清IL-6水平和血清TNF-α水平，減輕胰腺病理損害，可能與下調巨噬細胞內質網的PERK mRNA表達，抑制UPR信號傳導有關，但具體作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，CQCQD可下調巨噬細胞PERK mRNA表達，作用于內質網UPR，在轉錄后水平減少IL-6及TNF-α等促炎因子釋放，緩解AP大鼠胰腺病理損害。但具體作用機制尚需進一步研究。

[1]Windisch O, Heidegger C P, Giraud R,etal. Thoracic epidural analgesia: a new approach for the treatment of acute pancreatitis[J]. Crit Care, 2016, 20(1): 116.

[2]Bravo R, Parra V, Gatica D,etal. Endoplasmic reticulum and the unfolded protein response: dynamics and metabolic integration[J]. Int Rev Cell Mol Biol, 2013, 301: 215-290.

[3]Xue P, Guo J, Yang X N,etal. Changes of neuronal acetylcholine receptor alpha 7 of peritoneal macrophage in experimental acute pancreatitis treated by Chaiqin Chengqi Decoction [J]. Chin J Integr Med , 2014, 20(10): 770-775.

[4]Jia G, Xiaoxiang W, Ruijie L,etal. Effect of Chaiqinchengqi decoction on inositol requiring enzyme 1α in alveolar macrophages of dogs with acute necrotising pancreatitis induced by sodium taurocholate [J]. J Tradit Chin Med, 2015, 35(4): 434-439.

[5]Guo J, Xue P, Yang X N,etal. The effect of Chaiqin Chengqi Decoction on modulating serum matrix metalloproteinase 9 in patients with severe acute pancreatitis[J]. Chin J Integr Med, 2013, 19(12): 913-917.

[6]Wang L, Li Y, Ma Q,etal. Chaiqin Chengqi Decoction decreases IL-6 levels in patients with acute pancreatitis[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2011, 12(12): 1034-1040.

[7]Adolph T E, Niederreiter L, Blumberg R S,etal. Endoplasmic reticulum stress and inflammation[J]. Dig Dis, 2012, 30(4): 341-346.

[8]Khanna A K, Meher S, Prakash S,etal. Comparison of Ranson, Glasgow, MOSS, SIRS, BISAP, APACHE-II, CTSI Scores, IL-6, CRP, and Procalcitonin in Predicting Severity, Organ Failure, Pancreatic Necrosis, and Mortality in Acute Pancreatitis[J]. HPB Surg, 2013, 2013: 367581.

[9]Ni Q, Sun K, Chen G,etal. In vitro effects of emodin on peritoneal macrophages that express membrane-bound CD14 protein in a rat model of severe acute pancreatitis/systemic inflammatory response syndrome[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(1): 355-359.

[10] 陳曉東, 謝偉洪, 程航. 急性胰腺炎并發全身炎癥反應綜合征與血漿CRP濃度的相關分析[J]. 放射免疫學雜志, 2013, 26(4): 534-535.

[11] 李娜, 王曉茵. 兒童急性胰腺炎與全身炎癥反應綜合征的關系探討[J]. 中國當代兒科雜志, 2008, 10(6): 715-718.

Effect of Chai Qin Cheng Qi Decoction on the Expression of mRNA of PKR-like ER Kinase of the Endoplasmic Reticulum of Alveolar Macrophages in Rats with Acute Pancreatitis

WangHaoyang,GuoJia,LuoRuijie,XiaQing,XuePing△.

DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,China

Objective To investigate the effect of Chai Qin Cheng Qi Decoction (CQCQD) on the mRNA expression of PKR-like ER kinase (PERK) of the alveolar macrophage (AM) in rats with acute pancreatitis (AP). Methods Thirty Sprague-Dawley (SD) rats were randomised into the control group, AP group and CQCQD group, and each group consisted of 10 SD rats. The rats in the AP group were given intraperitoneal injection with 20%L-arginine (2.5 g·kg-1·1 h-1×2), those in the CQCQD group were treated with CQCQD 0.2 mL/100g by gavage for three times with 2-hour intervals every time, and the rats in the control group were treated with saline in the same way as those in the CQCQD group. After 6 hours of the treatment, the pancreatic tissues were collected for pathological examination, the alveolar macrophage was examined to detect the mRNA expression of PERK, and the serum was assayed to determine the levels of IL-6 and TNF-α. Results The pancreatic histopathologic score of the AP group (8.8±0.5) was significantly higher than that of the control group (1.0±0.3) and that of the CQCQD group (5.4±0.6) respectively (P<0.05). The levels of serum IL-6 and TNF-α in the CQCQD group (48.3±10.7 pg/mL, 35.1±14.5 pg/mL) were significantly higher than those in the control group (35.1±10.6 pg/mL, 21.3±14.2 pg/mL) respectively (P<0.05), but they were significantly lower than those in the AP group (67.5±13.1 pg/mL, 52.1±13.7 pg/mL) respectively (P<0.05). Compared with the control group, the expression levels of PERK mRNA in the AP group were significantly up-regulated (P<0.05), while those in the CQCQD group were significantly down-regulated after the treatment (P<0.05). Conclusion The mechanism of reducing the serum IL-6 and TNF-α by CQCQD may be correlated with the down-regulation of the mRNA expression of PERK in the alveolar macrophage.

Chai Qin Cheng Qi Decoction; PKR-like ER kinase; Acute pancreatitis; Alveolar macrophage

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170111.1047.012.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.004

國家自然科學基金(No. 81403252、No. 81573766)

R285.5

A

△通信作者： 薛平，E-mail：duburongcheng@163.com