精氨酸加壓素對大鼠臂旁外側核AMPA和NMDA受體亞基mRNA表達的影響

曾議鋅，許麗麗， 朱云才，唐 新，羅雨晴，張 潔△，唐 瑜△

1.成都醫學院 檢驗醫學院(成都 610500)；2.成都醫學院 基礎醫學院(成都 610500)；3.成都醫學院 公共衛生系(成都 610500)

精氨酸加壓素對大鼠臂旁外側核AMPA和NMDA受體亞基mRNA表達的影響

*曾議鋅1，許麗麗1， 朱云才2，唐 新2，羅雨晴3，張 潔2△，唐 瑜2△

1.成都醫學院 檢驗醫學院(成都 610500)；2.成都醫學院 基礎醫學院(成都 610500)；3.成都醫學院 公共衛生系(成都 610500)

目的 探討精氨酸加壓素(AVP)對大鼠臂旁外側核(LPB)使君子酸(AMPA)受體和N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體mRNA表達的影響。方法 腹腔連續注射AVP1周后，采用RT-PCR技術，半定量分析大鼠LPB AMPA受體亞基GluR1、GluR2、GluR3和GluR4以及NMDA受體亞基NR2A和NR2B mRNA表達的變化。結果 與對照組比較，AVP組大鼠LPB GluR1 mRNA 表達明顯上調(P<0.05), 而GluR2、GluR3和GluR4 mRNA表達雖有上調趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，NR2A和NR2B mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。結論 AVP通過上調LPB AMPA受體，特別是GluR1亞基，而不是NMDA受體，增強LPB谷氨酸能突觸傳遞。

精氨酸加壓素；臂旁外側核；AMPA受體；NMDA受體

精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)是由下丘腦視上核和室旁核神經元合成的一種九肽物質，在中樞具有神經遞質或調質作用[1]。AVP不僅是體內一種重要的內源性退熱物質，而且參與正常體溫調節，引起調節性低溫反應[2]，其降溫機制與興奮視前區-下丘腦前部熱敏神經元和抑制冷敏神經元的放電活動有關[3]。AVP的釋放受環境溫度影響，暴露在高溫和低溫環境均可提高下丘腦AVP水平[4]。

最近研究[5-7]發現，臂旁核(PBN)的外側核，即臂旁外側核(lateral parabrachial nucleus, LPB)是皮膚前饋溫度信號上傳通路的重要中繼站，直接上傳經脊髓傳來的皮膚溫度信號至體溫中樞視前區，引起冷、熱環境中的防御性體溫調節反應，維持體溫穩定。有研究[5-6]表明，阻斷LPB N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體和使君子酸(AMPA)谷氨酸能受體，完全抑制皮膚冷、熱刺激引起的防御性體溫調節反應，提示LPB谷氨酸能遞質-受體系統參與了前饋體溫調節。有報道[8]稱，PBN有AVP免疫陽性神經元分布，且AVP能調節LPB神經元谷氨酸能興奮性突觸傳遞，但AVP是否影響LPB谷氨酸能受體表達尚不清楚。本實驗采用RT-PCR技術，半定量分析AVP對大鼠LPB AMPA受體亞基GluR1、GluR2、GluR3和GluR4以及NMDA受體的調節性亞基NR2A和NR2B mRNA表達的影響，為AVP可能參與低溫或高溫環境中的體溫調節過程提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級健康雄性SD大鼠12只，體質量200～220 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供。實驗分兩組，即鹽水對照組(n=6)和AVP實驗組(n=6)。每天上午10時，腹腔注射AVP 10 μg/kg (10 μg/mL)或生理鹽水1 mL/kg，連續注射1周。

1.2 主要試劑和設備

AVP為美國Sigma公司產品，用生理鹽水將AVP配制成10 μg/mL的溶液, 存于-20 ℃冰箱備用。Trizol和瓊脂糖由美國Invitrogen公司生產；焦碳酸二乙酯(DEPC)由Sigma公司生產； PrimeScript RT reagent Kit、PCR Master Mix和DNA Marker DL 1000均為大連寶生物工程有限公司生產；BeyoRed DNA上樣緩沖液(6X)為碧云天生物技術公司產品；RNALater為Life產品；戊巴比妥鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯仿和無水乙醇購自成都科龍化工試劑有限公司。 PCR儀(ABI-Veriti96，ABI美國應用生物系統公司)；化學發光凝膠成像儀(Universal Hood II，美國BioRad公司)；紫外分光光度計(NanoDrop2000，美國ThermoFisher儀器有限公司)；電泳儀(JY200C，北京君意東方電泳設備有限公司)；電泳槽(JY-SPFT，北京君意東方電泳設備有限公司)；低溫離心機(C2500，湖南湘儀實驗儀器廠)；優普超純水制造系統(UPH-Ⅱ-10T, 成都超純科技有限公司)；旋渦混合器(XH-B，江蘇康健醫療用品有限公司)；電子天平(PPT-A+100，美國康州HZ電子科技有限公司)；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(SYQ-DSX-280B，上海申安醫療器械廠)；微波爐(MF-2270EQ，青島海爾微波制品有限公司)。

1.3 引物設計與合成

根據NCBI GenBank中大鼠GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、NR2A、NR2B和β-actin mRNA序列，采用軟件Primer Premier 5.0進行引物設計(表1)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 AMPA和NMDA受體亞基及β-actin的引物序列

1.4 取材

兩組大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，迅速斷頭取腦，在DEPC處理過的冰PBS液中修塊，制備含LPB的腦干塊，在下丘尾端橫斷腦干，暴露出一新月形透明區，即LPB，小心剝離LPB，迅速置于RNALater中，4 ℃過夜后，-20 ℃保存備用。

1.5 總RNA提取與定量

參照Trizol試劑說明書，在1 mL Trizol中用細玻棒將標本研磨勻漿，加入0.2 mL氯仿，離心后，吸取上清，加入0.5 mL異丙醇，離心沉淀后，棄上清，加入75 %乙醇(DEPC水配制) 1 mL，充分洗滌沉淀后，離心，棄上清，室溫干燥，加入15 μL DEPC水溶解，紫外分光光度計測定RNA濃度及純度， OD260/280=1.7～2.0。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測RNA完整性，可見明亮的28S、18S及較淡5S 3條帶， 無DNA污染條帶。

1.6 cDNA合成

采用gDNA Eraser去除基因組DNA后，以Oligo-dT為引物，參照PrimeScript RT reagent Kit說明書進行反轉錄，反轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。所得cDNA于-20 ℃儲存備用。

1.7 PCR檢測目的基因mRNA表達

20 μLPCR反應體系: 10 μLPCR Master Mix，上、下游引物各0.8 μL(10 μM)，cDNA 2 μL，最后加PCR Water至20 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min， 然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR結束后，各取10 μL PCR產物，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(100 V×30 min)，電泳結束后使用凝膠儀成像，再用Quantity One 軟件分析數據，獲得各電泳條帶的平均光密度值，以AMPA或NMDA受體亞基與β-actin的灰度比值表示其mRNA的相對表達含量。

推薦理由:本書是一部史學史力作，著者是中國社會史學會會長。中國社會史學科伴隨著改革開放而復興成長，逐步發展成為歷史學中的一門顯學。本書詳細論述了新時期中國社會史研究從發軔、成長到壯大的過程，闡述這一過程的演變，全面總結各類研究成果、理論論爭及學術流派的形成，呈現這一學科的繁榮景象，印證了40年來中國學術界的發展歷程。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 AVP對LPB內AMPA受體亞基mRNA表達的影響

在鹽水對照組，AMPA受體亞基GluR4在6只大鼠的所有樣品均可見一特異性條帶, 與預期擴增片斷大小相符，GluR1和GluR2在1只大鼠的樣品未見擴增條帶，GluR3則在兩只大鼠的樣品未見擴增條帶。腹腔連續注射AVP 1周后，AVP實驗組6只大鼠LPB均檢測到了GluR1、GluR2、GluR3和GluR4 mRNA，與鹽水對照組比較，GluR1 mRNA 表達有明顯上調(P<0.05), 而GluR2、GluR3和GluR4 mRNA表達雖有上調趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05) (圖1A～D和圖2)。

圖1 大鼠LPB AMPA受體亞基GluR1、GluR2、GluR3和GluR4以及NMDA受體亞基NR2A和NR2B mRNA RT-PCR 產物電泳圖

2.2 AVP對LPB內NMDA受體亞基mRNA表達的影響

在鹽水對照組，NMDA受體的兩個調節性亞基NR2A和NR2B在6只大鼠的所有樣品均可見一特異性條帶, 與預期擴增片斷大小相符。腹腔注射AVP 1周后，在1只大鼠的樣品未見NR2A擴增條帶，在6只大鼠樣品均檢測到NR2B mRNA表達，但與鹽水對照組比較，NR2A和NR2B mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)(圖1E～F和圖2)。

圖2 AVP對LPB AMPA受體和NMDA受體亞基mRNA表達的影響

3 討論

LPB谷氨酸能遞質-受體系統除了參與前饋體溫調節，還與心血管[11]等內臟活動的調節有關，因此，AVP上調LPB AMPA受體，也可能是AVP心血管活動的中樞調節機制之一。Chen 等[8]的電生理實驗顯示，短時間應用AVP可能通過突觸前膜機制，抑制LPB谷氨酸能傳遞。本實驗提示，長期應用AVP則可通過上調GluR1表達，代償性增強LPB谷氨酸能突觸傳遞。此外，AMPA受體不同亞基上調程度不均，提示AVP可能還引起了LPB神經元AMPA受體亞基重組。

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Effect of Arginine Vasopressin on the Subunit mRNA Expressions of AMPA and NMDA Receptors in Lateral Parabrachial Nucleus of Rats*

ZengYixin1,XuLili1,ZhuYuncai2,TangXin2,LuoYuqing3,ZhangJie2△,TangYu2△.

1.SchoolofLaboratoryMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 3.DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To investigate the effect of arginine vasopressin (AVP) on the subunit mRNA expressions of AMPA and NMDA receptors in lateral parabrachial nucleus (LPB) of rats. Methods The mRNA expressions of GluR1, GluR2, GluR3 and GluR4 in the AMPA receptors and those of NR2A and NR2B in the NMDA receptors were detected with RT-PCR after one-week intraperitoneal injection of AVP. Results Compared with the expressions in the control group, the mRNA expression of GluR1 in the experiment group was significantly upregulated by AVP in the LPB (P<0.05), while the mRNA expressions of GluR2, GluR3, GluR4, NR2A and NR2B weren′t upregulated significantly (P>0.05). Conclusion AVP enhances the glutamatergic transmission of LPB by upregulating AMPA receptors, especially GluR1, rather than NMDA receptors.

Arginine vasopressin; Lateral parabrachial nucleus; AMPA receptors; NMDA receptors

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161222.1115.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.006

四川省教育廳課題(No:12ZB021);發育與再生四川省重點實驗室研究基金資助課題(No:SYS14-004)；成都醫學院大學生創新實驗計劃項目(No:CXXS201406)

R338.1

A

△通信作者: 張潔，E-mail: zhangjiefa8888@126.com；唐瑜，E-mail: yurenxiao3@netease.com