小劑量葉酸預防妊娠期高血壓有效劑量的實驗研究*

曾子倩，歐 愚，冷言冰，朱彥鋒，余小平，薛清萍，李亞超，韓 彬

成都醫學院 公共衛生系(成都 610500)

小劑量葉酸預防妊娠期高血壓有效劑量的實驗研究*

曾子倩，歐 愚，冷言冰，朱彥鋒，余小平，薛清萍，李亞超，韓 彬△

成都醫學院 公共衛生系(成都 610500)

目的 探討不同劑量葉酸對高同型半胱氨酸妊娠期SD大鼠血清葉酸及血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平的影響作用，找出預防妊娠期高血壓的最佳有效劑量。 方法 將40只12周齡雌性SD大鼠按照葉酸干預劑量分為4組：低、中、高3個劑量葉酸組[0.8 mg/(kg·d)，n=10]，中劑量葉酸組[1.6 mg/(kg·d)，n=10]、高劑量葉酸組[2.0 mg/(kg·d)，n=10]和對照組(滅菌水500 μL，n=10)。干預7 d后，將雌鼠和同品類雄鼠合籠，第2～3 天進行陰道栓檢測，將受孕大鼠納入研究，采用1%蛋氨酸飲食建立高同型半胱氨酸模型，干預前后分別抽取血液樣本，測定各組血清葉酸及血漿Hcy水平。 結果 32只雌鼠受孕并納入干預研究，4組SD大鼠體質量在干預前后比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；中劑量葉酸組、高劑量葉酸組與對照組比較，葉酸水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，高劑量葉酸組SD大鼠Hcy水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。 結論 不同劑量葉酸干預效果存在差異，在安全劑量下，高劑量組葉酸能夠提高妊娠期SD大鼠的葉酸水平和降低Hcy水平，從而達到預防妊娠期高血壓的目的。

葉酸；妊娠期高血壓；實驗研究

妊娠期高血壓疾病是產科常見的一類綜合征。世界衛生組織公布的數據中曾提到，2015年全世界約有30萬婦女死于妊娠相關疾病，約有260萬例死產嬰兒[1]。而妊娠期高血壓既是導致死產的前5位原因之一，也是我國孕產婦死亡的前3位原因之一，發生率達9.4%，較國際報道的平均發病率6.4%～7.0%更高[2]。同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產物，當Hcy高于15.0 mol/L稱為高同型半胱氨酸血癥(Hhcy)。研究發現，妊娠期高血壓的發生與Hhcy密切相關，而葉酸在降低血清Hcy水平中所起到的作用也日益被研究者認可。然而，長期服用不恰當劑量葉酸(≥1 mg/d)同樣存在安全隱患，如過量葉酸容易掩蓋B-12缺乏，從而導致貧血或老年認知障礙等疾病[3-4]。我國對孕期婦女的葉酸增補建議為孕前3個月和孕早期每天服用0.4 mg葉酸[5]，但這一劑量和時長在我國針對妊娠期高血壓的研究中未見明顯效果(RR=1.08)[6]。基于葉酸對高血壓預防作用的文獻回顧[7-8]，不同劑量、不同增補時長的葉酸對Hcy的作用效果存在差異。本研究采用動物實驗對葉酸降低妊娠期Hcy水平的有效劑量進行了研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1.1.1 動物選擇及樣本量 選擇12周±4 d周齡SD雌大鼠，體質量250～270 g(成都達碩動物科技有限公司提供)。共設置3個劑量組和1個對照組，按最低劑量組與對照組比較能夠出現統計學差異來計算每組樣本量，參照人衛版《動物實驗方法學》樣本量計算公式，設定α=0.05，β=0.2計算每組樣本量為5只，考慮到雌鼠的受孕概率及實驗可能造成的動物死亡，故共選取大鼠40只，每組10只，以保證實驗中樣本量充足。

1.1.2 動物飼養及分組 動物于室溫(24±2)℃，濕度(60±10)%，明暗循環12 h條件下飼養，飲水攝食自由。采用實驗流行病學中隨機、對照、雙盲設計，按照隨機數字表法，將40只大鼠隨機分成4組，每組10只大鼠。在本研究中，按照孕期婦女平均體質量50 kg的增補劑量0.4、0.8、1.0 mg/d分為3個劑量組，參照劑量換算方法[9]，估計雌性大鼠體質量為250～300 g, 大鼠的喂養劑量分別為：0.8 mg/(kg·d)(低劑量葉酸組), 1.6 mg/(kg·d),(中劑量葉酸組) 2.0 mg/(kg·d)(高劑量葉酸組)。對照組灌胃滅菌水500 μL/d。

1.2 實驗葉酸干預

對照組大鼠每天灌胃滅菌水，低、中、高3個劑量葉酸組每只大鼠分別按0.8、1.6、2.0 mg/(kg·d)劑量灌胃葉酸，干預7 d后，將雌鼠和同品類雄鼠合籠，第2、3 天連續進行陰道栓檢測，將受孕大鼠納入研究，采用1%蛋氨酸飲食建立Hhcy模型，孕期前7 d和孕期結束后大鼠眼眶靜脈取血，在含有EDTA的抗凝管中，以3 000 r/min離心10 min，取上層血清及血漿，-20 ℃冰箱保存。

1.3 大鼠Hhcy建模

4組大鼠均于孕8 d開始，予以1%蛋氨酸飼料喂養，構建妊娠期Hhcy模型。同時，每天給予3個干預組大鼠葉酸制劑干預，灌胃給藥；每天給予對照組大鼠滅菌水灌胃。

1.4 指標測定及方法

1.4.1 基本情況觀察 實驗期間每天觀察SD大鼠毛發、糞便及活動情況，并記錄攝食和飲水情況；每周對SD大鼠進行稱重。

1.4.2 大鼠血清葉酸濃度測定 血清葉酸測定用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 大鼠血漿Hcy濃度測定 大鼠眼眶靜脈取血，采用高效液相色譜法測量進行Hcy測定。

1.5 檢測試劑

葉酸購自美國Sigma公司，蛋氨酸購自北京索萊寶科技有限公司，血清ELISA檢測試劑盒購自美國Sigma試劑公司。酶標儀購自美國Thermo 公司。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 基本情況

根據受孕情況，每組最終納入8只受孕大鼠進行干預。實驗期間，大鼠毛發、糞便、活動等正常，對照組和低、中、高劑量葉酸組大鼠體質量緩慢增長(表1)，飲水及攝食量比較，差異均無統計學意義(表2)，實驗過程中大鼠無死亡。實驗數據進行重復測量方差分析，每周進行大鼠體質量監測，不同周數的體質量比較，差異有統計學意義(F=166.88，P<0.001)；不同組別間大鼠的體質量比較，差異無統計學意義(F=0.14，P=0.935)；時間與區組間未存在交互效應(F=0.24，P=0.996)。結果提示，本實驗的葉酸劑量對大鼠無明顯毒副作用。

表1 實驗期間4組SD大鼠體質量變化情況

表2 SD大鼠進食情況比較

2.2 大鼠血清葉酸水平變化情況

干預前，單因素方差分析結果顯示，4組大鼠血清葉酸水平均存在統計學差異(F=8.63，P<0.003)；經不同劑量葉酸干預后，協方差分析結果顯示，不同劑量組之間血清葉酸水平比較，差異有統計學意義(F=41.39，P<0.001)；兩兩比較結果顯示，中劑量(1.60 mg/kg)、高劑量葉酸組(2.0 mg/kg)大鼠血清葉酸與對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.001)，且高劑量葉酸組大鼠血清葉酸含量最高(表3)。

表3 SD大鼠干預前后血清葉酸水平比較

注：與對照組相比：*P<0.05

2.3 大鼠血漿Hcy水平變化

干預前，4組大鼠血漿Hcy水平比較，差異均無統計學意義(表4)，經不同劑量葉酸干預以及1%蛋氨酸飼料喂養后，統計分析結果顯示，各組大鼠血漿Hcy水平不同(F=127.529，P<0.01)，兩兩比較結果顯示，中、高劑量組血漿Hcy水平與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且中、高劑量組血漿Hcy水平降低，提示中、高劑量葉酸能夠降低1%蛋氨酸誘導的大鼠血漿Hcy水平。

表4 SD大鼠干預前后血漿Hcy水平比較

注：與對照組相比：*P<0.05

3 討論

妊娠期高血壓的發病機制十分復雜，國內外研究者對此提出了多種學說，其中，研究發現，Hcy水平是妊娠高血壓的一個獨立危險因素，容易引起不良的妊娠結局如妊娠高血壓或先兆子癇[10]。Hcy是一種含硫基的非必需氨基酸，為蛋氨酸代謝的一個重要代謝產物，其代謝異常可導致Hhcy，Hhcy會損傷血管內皮細胞，引起血液流變學、凝血系統、纖溶系統和微循環的紊亂，從而參與妊娠高血壓的發生、發展過程。葉酸是一種B族維生素，研究表明，增補葉酸可以增加血管內皮細胞合成一氧化氮，同時，葉酸作為Hcy代謝過程中重要的輔助因子，其水平的增高可促進Hcy的再甲基化進行，從而降低血清Hcy的濃度，達到降低Hhcy血壓的目的[11]。

大量研究顯示，葉酸對妊娠期高血壓的預防作用尚未達成共識，而增補劑量很可能是影響因素之一。最新研究[12]發現，服用葉酸可以降低罹患妊娠期高血壓的風險(RR=0.62)，其他類似研究[13]結論同樣支持這一結果。然而，葉酸對妊娠期高血壓疾病的預防作用在該領域研究中仍缺乏共識，Shim 等[14]研究顯示，單獨葉酸或者復合維生素的增補并未有效減少妊娠期高血壓或者先兆子癇的發病風險；2013年，我國一項大樣本隊列研究發現，育齡婦女在孕早期3個月每天增補0.4 mg葉酸對預防妊娠期高血壓并無顯著預防效果[6]。

本實驗采用低劑量蛋氨酸飼養來構建SD大鼠的高Hcy水平模型，孕前及孕期服用葉酸來控制Hcy水平的升高。結果發現，采用1%的蛋氨酸進行Hhcy血癥的建模成功，這與之前孟斌等[15]研究結果一致。分別經滅菌水和葉酸干預后，4組大鼠的Hcy水平均有所提高，而葉酸干預組Hcy水平提高較慢，且葉酸干預末期與對照組比較，Hcy水平差異有統計學意義。

對于葉酸的增補劑量，目前大多數研究推薦孕婦的增補劑量為0.4 mg/d，用于預防神經管缺陷、先天性心臟病等出生缺陷。但臨床數據發現，孕前與孕早期0.4 mg/d的增補對妊娠期高血壓的預防作用并不顯著。本實驗發現，在SD大鼠中，葉酸增補劑量的增加會使血清葉酸水平提高，從而降低血漿Hcy水平。但在3個劑量中，1.6 mg和2.0 mg劑量較0.8 mg劑量在血清葉酸增長中效果更為顯著，但在降低Hcy水平中，二者干預后的Hcy水平比較，差異并無統計學意義，因此，在劑量的選擇上，1.6 mg是取得控制妊娠期大鼠Hcy水平的最小劑量。

綜上所述，本研究通過動物實驗進行了葉酸預防妊娠期高血壓最佳有效劑量的探索，但葉酸增補的時長也是影響預防效果的因素之一，因此需要進一步開展實驗進行研究。

[1]WHO. Pregnant women must be able to access the right care at the right time, says WHO[R/OL]．2016．http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2016/antenatal-care-guidelines/en/.

[2]曹澤毅. 中華婦產科學[M].北京:人民衛生出版社,2008:398.

[3]Paul L, Selhub J. Interaction between excess folate and low vitamin B12 status [J]. Mol Aspects Med,2017,53:43-47.

[4]Fedosov S N, Brito A, Miller J W,etal. Combined indicator of vitamin B12 status: modification for missing biomarkers and folate status and recommendations for revised cut-points[J]. Clin Chem Lab Med, 2015, 53(8): 1215-1225.

[5]Zeng Z, Yuan P, Wang Y,etal. Folic acid awareness and intake among women in areas with high prevalence of neural tube defects in China: a cross-sectional study[J]. Public Health Nutr, 2011, 14(7): 1142-1147.

[6]Li Z, Ye R, Zhang L,etal. Folic Acid Supplementation During Early Pregnancy and the Risk of Gestational Hypertension and Preeclampsia[J]. Hypertension, 2013, 61(4): 873-879.

[7]郭方, 李笑天. 葉酸及多種維生素的補充對妊娠期高血壓疾病的預防作用[J]. 中國實用婦科與產科雜志, 2014, 30(8): 592-596.

[8]Zheng X, Pei L, Chen G,etal. Periconceptional Multivitamin Supplementation Containing Folic Acid and Sex Ratio at Birth in a Chinese Population: a Prospective Cohort Study[J]. Paediatr Perinat Epidemiol, 2015, 29(4): 299-306.

[9]黃繼漢, 黃曉暉, 陳志揚, 等. 藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2004, 9(9): 1069-1072.

[10] Mujawar S A, Patil V W, Daver R G. Study of serum homocysteine, folic Acid and vitamin b(12) in patients with preeclampsia [J]. Indian J Clin Biochem, 2011, 26(3): 257-260.

[11] Almassinokiani F, Kashanian M, Akbari P,etal. Folic acid supplementation reduces plasma homocysteine in postmenopausal women[J]. J Obstet Gynaecol, 2016, 36(4): 492-495.

[12] Hua X, Zhang J, Guo Y,etal. Effect of folic acid supplementation during pregnancy on gestational hypertension/preeclampsia: A systematic review and meta-analysis[J]. Hypertens Pregnancy, 2016, 35(4): 447-460.

[13] Bodnar L M, Tang G, Ness R B,etal. Periconceptional multivitamin use reduces the risk of preeclampsia[J]. Am J Epidemiol, 2006, 164(5): 470-477.

[14] Shim S M, Yun Y U, Kim Y S. Folic acid alone or multivitamin containing folic acid intake during pregnancy and the risk of gestational hypertension and preeclampsia through meta-analyses [J]. Obstet Gynecol Sci, 2016, 59(2): 110-115.

[15] 孟斌, 高蔚娜, 楊繼軍, 等.高蛋氨酸飼料喂養的大鼠高同型半胱氨酸血癥模型的實驗研究[J]. 氨基酸和生物資源, 2011, 33(2): 53-56.

An Experimental Study on the Optimal Dose of Folic Acid Intake to Prevent the Gestational Hypertension

ZengZiqian,OuYu,LengYanbing,ZhuYanfeng,YuXiaoping,XueQingping,LiYachao,HanBin△.

DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To explore the effects of different doses of folic acid intake among pregnant SD mice with hyper-homocysteine and investigate the optimal dose for gestational hypertension. Methods 40 female SD mice with the age of 12 weeks were selected in the study and divided into four groups including high dose group (2.0 mg/kg·d), medium dose group (1.6 mg/kg·d), low dose group (0.8 mg/kg·d) and the control group, and each group consisted of 10 mice. The cohabitation of those female mice and the other male mice of same category was made after 7-day intervention. Then the vaginal suppository test was adopted after 2 to 3 days, and the pregnant mice were selected to create the hyper-homocysteine model with 1% methionine. The blood samples were collected before and after intervention respectively and assayed to determine the levels of serum folate and homocysteine. Results 32 pregnant mice were included in the intervention study. The weights of the SD mice in the three groups of low, medium and high doses were not significantly different from those in the control group before intervention. After the intervention, the levels of serum folate in the groups of medium and high doses were significantly higher than those in the control group (P<0.05); the level of homocysteine in the high dose group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). Conclusion The intervention effects are different among the different doses of folic acid intake, and the high-dose intake of folic acid could increase the level of serum folate in pregnant SD mice and decrease the level of serum homocysteine for the purpose of preventing gestational hypertension with safe dose.

Folic acid; Gestational hypertension; Experimental study

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170116.1700.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.008

成都醫學院自然科學基金資助項目(No: CYZ14-018)

R181.2+4

A

△通信作者：韓彬，E-mail:hanbin19871102@126.com