液體活檢指導下的非小細胞肺癌精準治療*

李均勇，王 椿, 周曉娟,丁振宇△

1.四川大學(成都 610065)；2.成都市龍泉驛區第一人民醫院 腫瘤科(成都 610100);3. 四川大學華西醫院 內分泌與代謝科(成都 610041); 4. 四川大學華西醫院 胸部腫瘤科(成都 610041)

液體活檢指導下的非小細胞肺癌精準治療*

李均勇1,2，王 椿3, 周曉娟4,丁振宇4△

1.四川大學(成都 610065)；2.成都市龍泉驛區第一人民醫院 腫瘤科(成都 610100);3. 四川大學華西醫院 內分泌與代謝科(成都 610041); 4. 四川大學華西醫院 胸部腫瘤科(成都 610041)

目的 探討液體活檢用于非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)精準治療的潛在價值。方法 本研究采用回顧性分析，納入2015年3月到2016年3月四川大學華西醫院胸部腫瘤科及肺癌中心液體活檢指導下，行精準治療的晚期NSCLC患者共11例。液體活檢方法采用擴增阻滯突變系統方法，或數字PCR方法，或下一代測序方法。靶向治療藥物包括吉非替尼、?？颂婺峒皧W西替尼。結果 11例患者分別口服吉非替尼(7例，63.6%)、?？颂婺?2例，18.2%)和奧西替尼(2例，18.2%)。7例患者最佳療效達到部分緩解(partial response，PR)(63.6%)，3例最佳療效為穩定(stable disease，SD)(27.3%)，有1例患者口服奧西替尼很快出現進展(progression disease，PD)(9.1%)。全組病人中位無進展時間(progression free survival，PFS)為8.0月(95%CI：2.3～13.7月)，中位總生存時間(overall survival, OS)仍未達到。有3例腫瘤組織與液體活檢結果不符的患者，療效分別為PR(2例)及PD(1例)。 結論 液體活檢用于指導NSCLC的精準治療值得進一步研究。

非小細胞肺癌；液體活檢；精準治療

肺癌是一類嚴重威脅人類生命健康的惡性疾病，其發病率和死亡率占惡性腫瘤第1位。肺癌中80%是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。NSCLC病人就診時，大部份都屬于不可手術的局部晚期或轉移性病人。對于這類病人，化療是主要治療方式，但化療的客觀緩解率(objective response rate，ORR)只有30%左右，中位無進展時間(progression free survival，PFS)約3～4個月，病人總生存時間(overall survival, OS)不足1年?；熜Ч邢耷乙堰_平臺期，很難繼續提高[1]。近年來，肺癌精準治療迅速成為肺癌研究的熱點。具有表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)基因突變的肺癌病人，采用靶向EGFR精準治療后，ORR可提高到70%左右，PFS提高到8個月左右[2]，OS可達2年[3]。

精確的基因檢測是個體化治療的前提，沒有EGFR基因突變的病人接受靶向藥物治療，有效率不足10%，效果僅與安慰劑相當[4]。因而，基因檢測越來越受到重視，已經成為肺癌的常規診療。基因檢測可極大地節約醫療成本，并真正實現精準治療,但基因檢測需要腫瘤組織，臨床活檢特別纖支鏡小活檢很難提供足夠組織，造成病人失去靶向治療機會，或是接受不適當的靶向治療,這是個體化治療面臨的難題。近年來，發展起來的液體活檢技術，通過檢測患者外周血游離DNA(cfDNA)中EGFR基因突變，顯示與腫瘤組織基因檢測極高一致性，文獻[5]報道達70%左右。這些結果提示，采用液體活檢可望用于指導NSCLC病人的精準治療。然而，現有研究僅將液體活檢作為腫瘤組織基因的補充與驗證，精準治療仍需要在腫瘤組織基因檢測指導下進行，將液體活檢結果直接指導精準治療，目前仍缺乏相應臨床驗證和研究支持。

本研究回顧納入了前期工作中采用外周液體活檢技術檢測cfDNA中EGFR基因突變狀況，并將結果作為指導EGFR靶向治療的晚期NSCLC病人11例?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究納入2015年3月到2016年3月四川大學華西醫院胸部腫瘤科及肺癌中心晚期NSCLC患者共11例。納入標準：患者經組織學或細胞學診斷證實為NSCLC；臨床分期Ⅳ期【包括Ⅳa及Ⅳb期，美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期第7版】；年齡≥18歲；至少有1個可測量的病灶；體力狀態評分0～2分；預期壽命>3個月；既往未接受化放療；血液學及肝腎功能正常，合并有心肺疾患者病情穩定。要求患者外周血EGFR基因檢測為敏感突變，腫瘤組織EGFR基因檢測不要求。經治醫生根據外周血EGFR基因檢測結果，給予小分子靶向治療(吉非替尼、厄洛替尼或?？颂婺峋?。排除標準：任何不穩定的系統性疾病(包括消化道潰瘍、活動性感染、3級高血壓、不穩定性心絞痛、充血性心力衰竭、肝腎疾病、代謝性疾病或骨折、傷口未愈合)；在5年內患有任何其他惡性腫瘤(完全治愈的宮頸原位癌、基底細胞或鱗狀上皮細胞皮膚癌除外)；體質量下降明顯，如6周內體質量下降10%；骨轉移灶為唯一觀察指標者。

1.2 基因檢測方法

本研究未限定基因檢測方法。采用臨床常規開展的擴增阻滯突變系統(ARMS)方法，包括雙環引物法(廈門艾德公司)及蝎子法(英國凱捷公司)，或是數字PCR(dPCR)方法，或是下一代測序(NGS)方法均可。本研究沒有病例采用直接測序法。

1.3 評價標準

治療前，行頭顱 MRI、胸部及上腹部螺旋增強 CT 和全身骨掃描作為基線，依據影像學檢查結果進行療效評價。按照 RECIST 1.1[6]評價標準，分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、穩定(stable disease，SD)和進展(progression disease，PD)。CR+PR 為客觀緩解率(objective response rate, ORR)，CR+PR+SD 為疾病控制率(disease control rate, DCR)。腫瘤進展時間(time-to-progression, TTP)為病人開始接受化療到腫瘤出現進展或癥狀明顯惡化的時間。

1.4 統計學分析

采用SPSS 18.0(美國IBM公司)進行數據處理。定性資料以例數(%)表示，采用McNemar檢驗，生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-Rank檢驗。檢驗水準α設定為0.05。

2 結果

2.1 病人特征

11例晚期NSCLC患者中，男5例，女6例，年齡42～68歲，中位年齡52歲，分期均為IV期，病理類型均為腺癌，不吸煙有3例，體力狀態均為1分。

2.2 基因狀態

11例患者腫瘤組織及外周血cfDNA的檢測方法及結果顯示：有3例患者二者檢測結果不一致，分別為1例腫瘤組織檢測失敗，其液體活檢為L858R+T790M聯合突變(4號患者)，1例腫瘤組織野生型，其液體活檢為L858R突變(5號患者)，1例腫瘤組織為19DEL+L858R聯合突變，其液體活檢為19DEL +T790M聯合突變(11號患者)。腫瘤組織與液體活檢結果符合率為72.7%(8/11)(表1)。

表1 患者基因檢測方法及結果

2.3 治療

現有研究[7]支持，吉非替尼、厄洛替尼及?？颂婺?種小分子靶向藥物療效相當。本研究不限定采用的靶向治療藥物，由經治醫生決定。11例患者中，采用吉非替尼有7例，采用?？颂婺?例，另有2例患者液體活檢發現攜有T790M突變者，口服奧西替尼。11例患者中，療效評價無CR，7例患者最佳療效達到PR，3例最佳療效為SD，有1例患者口服奧西替尼很快出現PD，總有效率(PR+SD)達90.9%(10/11)。全組病人中位PFS為8.0月(95%CI：2.3～13.7月)，中位OS仍未達到(圖1)。3例腫瘤組織與液體活檢結果不符的患者療效，4號及5號均為PR，11號患者病例胸水增多，腋窩淋巴結增多增大，療效為PD(圖2)。

圖1 全組病人的PFS

圖2 3例腫瘤組織與液體活檢基因檢測不一致的患者療效

3 討論

精準治療能提高肺癌治療緩解率，改善預后。無論是亞洲開展的IPASS、NEJ002、LUX-6或歐洲開展的EURTAC、LUX-3等 III期臨床試驗，均證實攜有EGFR基因突變的肺癌患者一線治療采用靶向治療，其療效遠優于傳統化療[1]。具有EGFR基因突變的患者中，接受過靶向治療的較未接受的生存時間更長[3]。精準治療迅速成為肺癌研究的熱點，也帶動了與之相應的基因檢測。腫瘤EGFR基因檢測方法從最初的直接測序法發展到液體活檢技術，但這些檢測方法面臨的問題是需要腫瘤組織，而臨床工作中取得活檢組織，特別是纖支鏡標本等小檢組織極少，難以滿足基因檢測的需要。

為解決腫瘤組織獲取困難的問題，隨著新檢測技術如dPCR和NGS應用日益廣泛，近年來，液體活檢技術漸漸興起[5]?，F有的液體活檢技術主要包括3類，即ARMS、dPCR與NGS。ARMS方法的原理是利用引物的3′端堿基與模板堿基不互補的情況下，PCR反應無法延伸。根據已知點突變設計引物，即可將有某種點突變的模板與正常模板區分開來，開展難度較低，在臨床廣泛應用，但對T790M繼發耐藥點突變檢測敏感性較低；dPCR檢測敏感性高，而且可以對突變EGFR基因豐度進行絕對定量，可惜不能對突變基因進行廣譜和多位點檢測；而NGS有與dPCR相當的檢測靈敏度，也可用于突變基因的廣譜乃至全基因譜篩查，是一種較理想的檢測方法，缺點是技術復雜，臨床難于廣泛開展。液體活檢與腫瘤組織基因檢測有很高的一致性，回顧性分析發現，液體活檢可望用于指導精準治療，但這一假設至今仍無臨床研究結果加以證實。本研究為回顧性分析，第1次為采用液體活檢結果指導的精準治療提供了依據。值得注意的是，現在開展的1項IIb期前瞻性BENEFIT研究還在進行中，其結果可能提供進一步證據。

本研究納入11例患者，腫瘤組織與液體活檢結果符合率為72.7%(8/11)，結果與多數報道[ 5,8-11]相一致。過去將腫瘤組織基因檢測作為金標準，液體活檢結果與之相比，得出檢測的“敏感性”與“特異性”。但腫瘤存在異質性，不同病人之間，同一病人不同部位腫瘤，乃至同一腫瘤病灶內部存在不同的惡性細胞種群。已有研究[12]表明，肺癌內部廣泛存在不同基因表達譜的細胞克隆，因此，EGFR在肺癌內部表達狀態可能并不一致，單純活檢取樣很難認識其全貌?，F在通過對腫瘤異質性的理解，腫瘤組織基因檢測亦不能作為金標準。液體活檢的結果只能通過能否指導臨床治療加以判斷。這也正是本研究及上述前瞻性BENEFIT研究的出發點。

本研究11例患者，總有效率(PR+SD)達90.9%(10/11)，超過了大多數EGFR敏感突變患者口服TKI治療的總有效率(約70%)。因本研究是一個小樣本探索性研究，這樣高的總有效率極有可能是源于小樣本量的偏倚因素造成的。而中位PFS為8.0月(95%CI：2.3～13.7月)，這一結果與大多數EGFR敏感突變患者口服靶向治療PFS時間相一致?？傊?，本研究所取得的結果與既往肺癌精準治療的療效相當，說明采用液體活檢結果指導精準治療在臨床工作中具有應用和推廣的前景。

本研究中，發現3例患者腫瘤組織與液體活檢結果不一致。仔細分析這3例患者，第1例患者(第4號)因腫瘤組織過少未能檢測出EGFR基因狀態，該名患者口服吉非替尼后療效達PR。第2例患者(5號)腫瘤組織EGFR基因野生型，其液體活檢為L858R突變，該名患者口服吉非替尼后療效達PR。第3例患者(11號患者)腫瘤組織EGFR基因狀態為19DEL+L858R聯合突變，而液體活檢為19DEL +T790M聯合突變，該例患者口服奧西替尼，但僅1月就出現PD。奧西替尼對EGFR基因經典敏感突變也有很好療效(FLAURA研究，現在進行中尚未正式發表，NCT02296125)，因此，該例患者臨床療效至少不支持腫瘤組織基因檢測結果。如果從臨床療效的觀點出發，3例基因檢測不一致的患者，其液體活檢結果較腫瘤組織更有可能為“真”。

本研究為回顧性研究，從單一中心納入病人，而且納入病例數較少(11例)，因而本研究僅僅是一種探索性研究，偏倚在所難免，結論需要謹慎解釋。同時，應當指出，采用液體活檢指導肺癌精準治療，至今國內外仍無直接報道，臨床也不常規開展，造成臨床病例極少，可供總結分析的例數更少。

綜上所述，本研究通過回顧性分析發現，液體活檢能很好地指導精準治療，3例檢測結果不一致的患者，臨床療效更支持液體活檢結果。本研究為液體活檢應用于臨床，指導肺癌精準治療提供了直接依據，研究結論需要進一步前瞻性研究加以證實。

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The Precision Therapy of Non-small Cell Lung Cancer Under the Guidance of Liquid Biopsy

LiJunyong1,2,WangChun3,ZhouXiaojuan4,DingZhenYu4△.

1.SichuanUniuersity,Chengdu610065,China; 2.CancerDepartment,TheFirstpeople′sHospitalofLongquanyiDistrict,Chengdu610100,China; 3.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,China; 4.DepartmentofThoracicCancer,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,China

Objective To explore the potential value of liquid biopsy in the precision therapy for the non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The retrospective method was adopted to analyze the data of 11 cases with advanced NSCLC treated with the precision therapy under the guidance of liquid biopsy from March of 2015 to March of 2016 in West China Hospital of Sichuan University. The liquid biopsy was performed by the methods including the amplification refractory mutation system, digital polymerase chain reaction (PCR) and next generation sequencing. The targeted drugs involved Gefitinib, Icotinib and Osimertinib. Results Among the 11 cases, 7 patients (63.6%) were given Gefitinib, 2 patients (18.2%) were given Icotinib and the other two patients were given Osimertinib. After the treatment, 7 cases (63.6) achieved the partial response (PR), 3 cases (27.3%) had the stable disease (SD), and the only one case (9.1%) taking Osimertinib had propression disease (PD). The median progression free survival (PFS) was 8.0 months (95%CI: 2.3-13.7 months) and the median overall survival was not reached. 3 patients had discordant results in the tests of tumors and liquid biopsy and they were 2 cases with PR and 1 case with PD respectively. Conclusion More further research is worth doing in the precision therapy for NSCLC under the guidance of liquid biopsy.

Non-small cell lung cancer; Liquid biopsy; Precision therapy

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170111.1046.010.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.012

國家自然科學基金(No:82172684)

R246.5

A

△通信作者：丁振宇, E-mail: dingzhenyu@scu.edu.cn