CD137/CD137L在食管癌中表達與預后的相關性分析

井賀楠++李靜雅++許芝山++楊如++路平

[摘要] 目的 研究食管癌中CD137/CD137L的表達情況，并分析兩者在食管癌中表達的意義及其與預后的關系。 方法 以購自上海芯超生物科技有限公司的食管癌組織芯片為研究對象，采用免疫組織化學方法檢測組織芯片中87例食管癌組織及其相應的癌旁組織中CD137/CD137L的表達情況；采用χ2檢驗或Fisher's精確檢驗的方法分析食管癌及癌旁組織中CD137/CD137L的表達與臨床病理特征的關系；采用Kaplan-Meier法分析CD137/CD137L的表達與食管癌患者預后的關系。 結果 在87例食管癌組織和相應的癌旁組織中CD137的陽性表達率分別為36.8%和72.4%，兩者比較差異有統計學意義（P < 0.05）。在87例食管癌組織和相應的癌旁組織中CD137L的陽性表達率分別為57.5%和96.6%，兩者比較差異有統計學意義（P < 0.05）。食管癌中CD137表達陽性率與浸潤深度相關（P < 0.05），而與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、臨床分期均不相關（P > 0.05）。食管癌中CD137L表達與臨床分期相關（P < 0.05），而與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度均不相關（P > 0.05）。CD137表達與食管癌患者的預后不相關（P=0.6301），CD137L表達與食管癌患者的預后相關（P=0.0368）。 結論 CD137L的表達水平是影響食管癌患者預后的獨立因素；CD137/CD137L可能在食管癌的抗腫瘤免疫中發揮重要作用。

[關鍵詞] 食管癌；CD137；CD137L；預后

[中圖分類號] R735.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（b）-0004-05

The expression of CD137/CD137L in esophageal cancer and its correlation with prognosis

JING He'nan1，2 LI Jingya1 XU Zhishan1 YANG Ru1 LU Ping2 ZHAO Baosheng3 ZHONG Genshen1，2

1.Research Center of Life Sciences & Technology， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He'nan Province， Weihui 453100， China； 2.Department of Oncology， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He'nan Province， Weihui 453100， China； 3.The Second Department of Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， He'nan Province， Weihui 453100， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CD137/CD137L in esophageal cancer， and analyze the significance and correlation with disease prognosis. Methods The esophageal tissue chip purchased from Xinchao Biological Technology co. LTD， Shanghai was taken as the research object. Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD137/CD137L of 87 cases of esophageal cancer tissues and its corresponding adjacent tissues in the tissue chip. Chi-square test or Fisher's inspection method was used to analyze the relationship of the expression of CD137/CD137L and the clinical pathological features in esophageal cancer tissue and corresponding adjacent tissue. Kaplan-Meier method was used to analyze the relationship between the expression of CD137/CD137L and the prognosis of esophageal cancer. Results The positive expression rate of CD137 in 87 cases esophageal cancer tissues and corresponding adjacent tissue was 36.8% and 72.4% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of CD137L in 87 cases esophageal cancer tissues and corresponding adjacent tissue was 57.5% and 96.6% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of CD137 in esophageal carcinoma tissues was related to depth of invasion （P < 0.05）， but no relation with gender， age， tumor site， differentiated degree and clinical stage （P > 0.05）. The positive expression rate of CD137L in esophageal carcinoma tissues was related to clinical stage （P < 0.05）， but no relation with gender， age， tumor site， differentiated degree and depth of invasion （P > 0.05）. The expression rate of CD137 was not related with the prognosis of esophageal cancer （P=0.6301）. The expression rate of CD137L was related with the prognosis of esophageal cancer （P=0.0368）. Conclusion The expression level of CD137L is a prognostic factor of esophageal cancer； CD137/CD137L may play an important role in antitumor immunity of esophageal cancer.

[Key words] Esophageal cancer； CD137； CD137L； Prognosis

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發病率在所有腫瘤中居第4位[1]。盡管有多種治療策略，但食管癌5年生存率仍低于40%[2]，新的治療手段仍有待進一步研發和探索。近些年來研究發現免疫治療有望成為新的腫瘤治療方法。眾所周知，T淋巴細胞在抗腫瘤免疫中發揮主要作用，而T淋巴細胞的激活需要抗原呈遞信號與協同刺激信號的雙重協同刺激。研究發現，通過應用特定協同刺激分子的激動性或者抑制性單克隆抗體信號來調節機體的抗腫瘤免疫反應可達到抗腫瘤的效果[3]。CD137/CD137L是繼PD-1/PD-L1、CD28/B7之后的又一重要的共刺激分子。CD137具有促進活化T細胞向腫瘤部位轉移、抑制活化T細胞的凋亡、增強毒性殺傷T細胞的殺傷毒性的作用[4]。因此CD137/CD137L一度成為腫瘤免疫治療領域的研究熱點。近些年來，特異性的激動型抗CD137單克隆抗體被開發并進行臨床實驗，初步顯現出其增強機體抗腫瘤免疫應答的作用[5-6]。然而CD137/CD137L在食管癌中表達情況還少有文獻報道，因此本研究通過檢測分析食管癌中CD137/CD137L的表達，并對比相應臨床病理特征來探討兩者在食管癌中表達的意義及與預后的關系，為CD137/CD137L相關的免疫治療在食管癌中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食管癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，產品編號：[食管，180] HEso-Squ180Sur-03，所有患者術前均未接受過任何治療，具有完整的臨床資料；CD137單克隆抗體購自美國Abcam公司；CD137L單克隆抗體購自SinoBiological公司。山羊抗兔單克隆抗體、DAB顯色液、過氧化氫均購自上海基因科技生物公司；改進型枸櫞酸鹽抗原修復液購自博士德生物公司；山羊血清購自碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

將組織芯片進行常規脫蠟、復水，然后按照標準的免疫組織化學操作流程逐步進行抗原修復、中和內源性的過氧化氫酶、血清封閉、滴加一抗（濃度1∶50）、4℃過夜、滴加二抗（濃度1∶100）、DAB顯色、復染、中性樹膠封片、觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。對于陽性染色結果的判定采用雙盲法進行，由2名高年資病理科醫師獨立讀片。結果判定：CD137和CD137L的陽性表達主要定位于細胞質及細胞膜，陽性表達表現為黃色或棕黃色顆粒。每張切片隨機挑選5個視野（400×），統計細胞數，先根據陽性細胞所占的百分數計分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；再根據陽性細胞著色程度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐黃色為3分。將兩者相乘所得的總分進行結果判定，分別對應4種表達強度。陰性（-）：評分0～1分，弱陽性（+）：評分2～4分，中度陽性（++）：評分5～8分，強陽性（+++）：評分9～12分；將“+～+++”統計為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher's精確檢驗；采用Kaplan-Meier法比較生存情況，并行log-rank檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管癌和相應癌旁組織中CD137的表達情況

食管癌細胞上CD137無明顯可見的陽性表達。87例食管癌組織中有32例CD137表達陽性，陽性率為36.8%；相應癌旁組織中CD137表達陽性63例，陽性率為72.4%；兩者比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1、圖1（封四）。

2.2 食管癌和相應癌旁組織中CD137L的表達情況

87例食管癌組織中，CD137L表達陽性50例，陽性率為57.6%，顯著低于相應癌旁組織中的96.6%，兩者比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1、圖1（封四）。

表1 CD137、CD137L在食管癌和相應癌旁組織中表達情況（例）

2.3 食管癌組織中CD137表達與臨床病理特征的關系

在87例食管癌組織中CD137陽性表達率與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、臨床分期均不相關（P > 0.05），而與浸潤深度相關（P < 0.05）。見表2。

表2 食管癌組織中CD137表達與臨床病理特征的關系（例）

2.4 食管癌組織中CD137L表達與臨床病理特征的關系

在87例食管癌組織中CD137L陽性表達率與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度均不相關（P > 0.05），而與臨床分期相關（P < 0.05）。見表3。

2.5 食管癌組織中CD137、CD137L的表達與患者預后相關性

食管癌組織中CD137表達與食管癌患者的預后不相關（P=0.6301）；CD137L表達與食管癌患者的預后相關（P=0.0368）。見圖2、3。

3 討論

腫瘤的免疫治療是運用免疫調節分子增強機體抗腫瘤反應來治療腫瘤的新方法。協同刺激分子是一類在機體免疫反應中發揮重要作用的調節分子。其中，CD137及其配體CD137L是繼CD28/B7之后的又一重要的協同刺激分子。研究表明，CD137主要表達于活化的T細胞、自然殺傷細胞、單核細胞表面[7]，具有促進T細胞增殖分化、促進細胞因子產生[8]、增強毒性殺傷細胞活性[9]的功能。另有研究顯示，CD137固有表達CD4+CD25+免疫調節性T細胞[10]。而機體抗腫瘤免疫反應主要依賴于T淋巴細胞介導的細胞免疫[11]。這都提示CD137在抗腫瘤免疫反應中發揮重要作用。

CD137屬于腫瘤壞死因子超家族的一種跨膜糖蛋白，其主要表達于活化的T細胞、NK細胞以及樹突狀細胞表面[7]。然而CD137在實體腫瘤細胞上表達情況頗有爭議。Broll等[12]研究發現，CD137在惡性腫瘤中呈現高表達，而在良性腫瘤、炎癥及正常組織中不表達，陽性表達主要分布于腫瘤組織的血管壁上。新近的研究發現[13]，霍奇金淋巴瘤的RS細胞上亦存在CD137的表達，其陽性表達率為85.7%。而在一項結腸癌的研究中發現，結腸癌細胞上CD137的表達呈陰性[14]。為研究CD137在食管癌組織細胞中的表達，本研究采用免疫組織化學的方法對87例食管癌組織和相應癌旁組織中的CD137表達進行檢測。結果顯示，食管癌組織中CD137的陽性表達主要分布于腫瘤的間質細胞中，87例食管癌組織中有32例為陽性，陽性率為36.8%，而在食管癌腫瘤細胞中CD137的表達均為陰性；而CD137在相應的癌旁組織中的表達陽性率為72.4%，明顯高于食管癌組，兩者比較差異有統計學意義（P < 0.05）。

CD137需要與其唯一的配體CD137L相結合形成復合物才能發揮其生物活性[15]，其分子機制目前還不太清楚。研究證實，CD137L表達于多數實體性腫瘤細胞上[16]。本研究通過對87例食管癌組織中CD137L的表達情況進行檢測分析，也證實了這一觀點；食管癌組織中CD137L的表達陽性率為57.6%，明顯低于相應癌旁組織中CD137L的陽性表達（96.6%），兩者差異有統計學意義（P < 0.05）。

腫瘤組織中低表達和不表達免疫共刺激分子是腫瘤免疫逃逸的機制之一[17]。本研究顯示，食管癌組織中CD137和CD137L的表達水平均低于癌旁組織，表明在食管癌中存在免疫共刺激分子的表達抑制，其具體的分子機制尚不清楚。研究證實，激活機體抗腫瘤免疫的關鍵是免疫細胞識別腫瘤組織中的特異性抗原，而腫瘤組織中常低表達或不表達特異性的抗原[18]，這也是腫瘤細胞逃避免疫監視的重要原因。另外，腫瘤組織中存在轉化生長因子-β、白介素-10[19]等免疫抑制因子的免疫抑制作用導致腫瘤組織內活化的T淋巴細胞減少，而CD137主要表達于激活狀態的T細胞上，因此推測食管癌中CD137陽性淋巴細胞數低于相應癌旁組織可能與此相關。

本研究將食管癌中CD137和CD137L的表達與患者臨床病理資料進行對比分析發現，CD137的表達與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、臨床分期均不相關（P > 0.05），而與浸潤深度相關（P < 0.05），即隨著食管癌浸潤深度的增加，CD137的表達逐漸降低；CD137L的表達與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度均不相關（P > 0.05），而與臨床分期相關（P < 0.05），即隨著臨床分期的增加，CD137L的表達逐漸降低。提示食管癌中CD137和CD137L的表達可能與患者不良預后相關。本研究分別對87例食管癌患者的生存期進行生存分析，結果顯示，CD137L的表達與食管癌患者的預后相關（P=0.0368），而CD137的表達與食管癌患者的預后不相關（P=0.6301）。這可能與CD137在食管癌組織中存在表達抑制相關。同時也為CD137和CD137L相關的免疫治療在食管癌中的應用提供了一個理論基礎。

綜上所述，本研究通過免疫組化的方法初步證實了食管癌組織中CD137和CD137L的表達均低于相應的癌旁組織。CD137和CD137L在食管癌中的表達分別與浸潤深度和臨床分期相關。由此推測CD137/CD137L可能在食管癌的抗腫瘤免疫中發揮重要作用。這為CD137/CD137L相關的免疫治療在食管癌中的應用提供了理論基礎，但本研究還存在諸多的不足之處，為了得到更精確的評估，還需要大樣本研究和長時間隨訪進一步驗證。

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（收稿日期：2016-09-21 本文編輯：程 銘）