HPLC法測(cè)定卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)

趙迎春，韓繼永

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HPLC法測(cè)定卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)

趙迎春1，韓繼永2

（1. 江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校，江蘇 徐州 221116； 2. 江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司, 江蘇 南京 211112）

：建立卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定法。：以Shimpack VP-ODS為色譜柱；以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(20:30:50)為流動(dòng)相A，以甲醇-乙腈（40：60）為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫0～25 min，流動(dòng)相B 20%~30%；25～40 min，流動(dòng)相B 30%~80%；40～50 min，流動(dòng)相B 80%；50～60 min，流動(dòng)相B 80%~20%）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。：各已知雜質(zhì)在0.05~5.0 ?g/mL范圍為線性關(guān)系良好（≥0.999），各雜質(zhì)與主峰的分離度良好；溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好，精密度和重復(fù)性RSD均小于5.0%；各已知雜質(zhì)的回收率均在95.42%~108.6%的范圍內(nèi)，RSD均小于3.42%（= 9）。：本法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，適用于卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。

高效液相色譜法(HPLC)；卡巴他賽；有關(guān)物質(zhì)

前列腺癌是男性常見惡性腫瘤，常發(fā)病于老年男性，在美國(guó)是除在皮膚癌之外第二大常見男性癌癥。據(jù)疾病防控中心最近統(tǒng)計(jì)報(bào)道，2006年約有203 415名男性罹患前列腺癌，其中28 372人死亡。卡巴他賽（Cabazitaxel）是一種微管抑制劑，適用于聯(lián)合潑尼松治療，做為二線治療藥，對(duì)已接受過多西他賽治療的激素難治性轉(zhuǎn)移性前列腺癌（MHRPC）患者。2010年6月，美國(guó)FDA經(jīng)優(yōu)先審批程序批準(zhǔn)了Sanofi-Aventis公司開發(fā)的卡巴他賽注射液上市，商品名為Jevtana，用于治療男性前列腺癌，被推薦在使用常用晚期前列腺癌藥物多烯紫杉醇，無效甚至病情加重時(shí)，首選的用于治療晚期、抗激素型前列腺癌的藥物[1]。本品的研究，有利于卡巴他賽在國(guó)內(nèi)的推廣，為患者提供更多的治療機(jī)會(huì)。

卡巴他賽為半合成化合物，其雜質(zhì)的種類非常復(fù)雜，檢測(cè)難度較大。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，對(duì)卡巴他賽有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的報(bào)導(dǎo)極少，有個(gè)別文章作了報(bào)導(dǎo)，但對(duì)已知雜質(zhì)的研究不夠深入[2-4]，筆者通過自行摸索，建立了卡巴他賽有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，以便進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；Seven-Muti S40精密pH計(jì)（梅特勒-托利多公司）；BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）、KH-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

卡巴他賽對(duì)照品，批號(hào)：S12102101，自制。卡巴他賽原料：批號(hào)：121101，121102，121201，自制；雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)K、雜質(zhì)L、雜質(zhì)N、雜質(zhì)O、雜質(zhì)P，為卡巴他賽合成起始物料、副產(chǎn)物及中間體，自制。甲醇、乙腈均為色譜級(jí)，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimpack VP-ODS，250 mm×4.6 mm，5 m；以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶30∶50)為流動(dòng)相A，以甲醇-乙腈（40∶60）為流動(dòng)相B；線性梯度洗脫（0～25 min，流動(dòng)相B 20%~30%；25～40 min，流動(dòng)相B 30%~80%；40～50 min，流動(dòng)相B 80%；50～60 min，流動(dòng)相B 80%~20%）；流速為1.0 mL/min ；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取卡巴他賽對(duì)照品和各雜質(zhì)對(duì)照品適量，分別加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含各雜質(zhì)0.25 mg、含卡巴他賽2.5 mg的溶液，作為貯備液。分別取上述貯備液各1 mL混勻，精密量取上述溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，卡巴他賽與各雜質(zhì)間的分離度良好，見圖1。

2.3 方法專屬性考察

精密稱取本品約10 mg，共5份，置20 mL量瓶中，分別加1 mol/L鹽酸溶液2 mL，放置4 h；加30%的過氧化氫溶液2 mL，放置4 h；加甲醇2 mL使溶解，在強(qiáng)光4 500 LX下照射4 h；加甲醇2 mL使溶解，并在100 ℃水浴中加熱4 h；加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，放置5 min；上述溶液分別用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述破壞后的供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察降解產(chǎn)物的分離度情況，本品在光照、氧化、高溫、酸性條件下均無明顯破壞。在堿性溶液中極易被破壞，產(chǎn)生一個(gè)較大的雜質(zhì)，經(jīng)過確證為雜質(zhì)A。各條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物與主峰的分離良好。采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行峰純度檢測(cè)，結(jié)果表明各破壞條件下主峰的純度因子均大于0.999。因此，可以推測(cè)雜質(zhì)A為卡巴他賽的主要降解產(chǎn)物。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

1-雜質(zhì)A；2-雜質(zhì)G；3-雜質(zhì)L；4-雜質(zhì)C；5-雜質(zhì)B；6-卡巴他賽；7-雜質(zhì)J；8-雜質(zhì)D；9-雜質(zhì)O；10-雜質(zhì)F；11-雜質(zhì)E；12-雜質(zhì)P；13-雜質(zhì)K；14-雜質(zhì)N。

2.4 線性關(guān)系考察

取上述各已知雜質(zhì)對(duì)照品和卡巴他賽對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成0.05~5.0μg/mL的系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以卡巴他賽和雜質(zhì)A濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，分別進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，并計(jì)算各雜質(zhì)相對(duì)卡巴他賽的校正因子，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，本品各已知雜質(zhì)在0.05~5.0μg/mL的范圍內(nèi)，線性良好。部分已知雜質(zhì)的校正因子在0.9~1.1范圍之外，采用自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)時(shí)，需要加校正因子進(jìn)行校正。

2.5 精密度試驗(yàn)

取本品適量，加甲醇溶解并稀釋制成0.5 mg/mL的溶液，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算，主峰面積RSD為0.04%（=5），各雜質(zhì)峰面積的RSD均小于5.0%，表明本法精密度良好。

表1 各已知雜質(zhì)的線性范圍及校正因子研究

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：121101），加甲醇溶解并稀釋制成0.5 mg/mL的溶液，作為供試品溶液，精密量取1 mL置100 mL量瓶中，作為對(duì)照溶液。平行配制6份溶液，分別精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)的含量（雜質(zhì)A、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)L、雜質(zhì)O和雜質(zhì)P的含量分別乘以相應(yīng)的校正因子），結(jié)果表明，雜質(zhì)G含量為0.06%，其他已知雜質(zhì)均未檢出，其他最大單一雜質(zhì)為0.05%，總雜質(zhì)含量為0.23%；各雜質(zhì)RSD均小于5.0%，本法的重復(fù)性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)：121101）適量，按“2.6”項(xiàng)下方法制成供試品溶液和對(duì)照溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h精密量取20mL，注入液相色譜儀，考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，供試品溶液主峰面積的RSD為0.54%（= 6），對(duì)照溶液主峰面積RSD為0.11%（= 6），雜質(zhì)個(gè)數(shù)及總量未見增加，表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

稱取卡巴他賽原料50 mg，平行9份，平均分為三組，分別置100 mL量瓶中，精密加入各已知雜質(zhì)對(duì)照品適量，使供試品溶液中含各已知雜質(zhì)的含量分別為0.05%、0.10%和0.15%，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。分別精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果各已知雜質(zhì)回收率范圍均在95.42%~108.6%的范圍內(nèi)，RSD均小于3.42%（= 9），表明本法的準(zhǔn)確度良好，見表2。

2.9 靈敏度試驗(yàn)

取卡巴他賽和已知雜質(zhì)對(duì)照品溶液，加甲醇溶解并逐級(jí)稀釋后進(jìn)行測(cè)定，按信噪比10∶1為定量限，3∶1為檢測(cè)限，結(jié)果表明卡巴他賽的定量限為0.32 ng，檢測(cè)限為0.10 ng，已知雜質(zhì)的定量限及檢測(cè)限見表2，各雜質(zhì)的檢測(cè)靈敏度符合要求。

表2 回收率試驗(yàn)和靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定

取卡巴他賽適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件和“2.6”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定樣品中有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果見表3，圖2。

表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.11 結(jié)論

以上研究表明，本檢查法專屬性強(qiáng)，精密度、重復(fù)性好，準(zhǔn)確度及靈敏度高，適用于本品的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

3 討論

（1）卡巴他賽為半合成化合物，起始原料為10-DAB衍生物為天然提取物的半合成品，且在合成過程中存在較多的副反應(yīng)，因此本品中存在的結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)種類較多，很難在色譜柱上達(dá)到基線分離。經(jīng)過摸索，我們采用梯度系統(tǒng)法，可改善各雜質(zhì)間的分離度效果。

圖2 樣品的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)色譜圖

1-空白溶劑；2-批號(hào)：121101；3-批號(hào)：121102；4-批號(hào)：121201

（2）經(jīng)過檢測(cè)，本公司的卡巴他賽的合成工藝可有效去除起始物料及中間體，且破壞性試驗(yàn)表明，本品的主要降解產(chǎn)物為雜質(zhì)A，部分產(chǎn)品中檢測(cè)出雜質(zhì)E和雜質(zhì)G，因此建議將雜質(zhì)A、雜質(zhì)E和雜質(zhì)G作為關(guān)鍵雜質(zhì)訂入標(biāo)準(zhǔn)。

（3）本文對(duì)卡巴他賽的起始物料、中間體及副產(chǎn)物能達(dá)到理想的分離效果，且國(guó)內(nèi)尚無對(duì)本品已知雜質(zhì)的檢測(cè)方法進(jìn)行深入研究的報(bào)導(dǎo)，本文對(duì)卡巴他賽的產(chǎn)業(yè)化推廣具有積極意義。

［1］馬培奇.美FDA批準(zhǔn)卡巴他賽二線治療轉(zhuǎn)移性激素不應(yīng)性前列腺癌[J].上海醫(yī)藥,2010,31(11):509．

［2］Peter de Bruijn, Anne-Joy M. de Graan, Annemieke Nieuweboer,et. Quantification of cabazitaxel in human plasma by liquid chromatography /triple-quadrupole mass spectrometry: A practical solution non-specific binding. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis [J]. 59 (2012) 117-122．

［3］A. Kort, M.J.X. Hillebrand, G.A. Cirkel,et.Quantification of cabazitaxel, its metabolite docetaxel and the determination of the demethylated metabolites RPR112698 and RPR123142 as docetaxel equivalents in human plasma by liquid Chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B[J] .925 (2013) 117-123．

［4］李明玥. 卡巴他賽有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)方法篩選[J]. 醫(yī)藥論壇, 2016, 4:187-188.

Determination of Related Substances in Cabazitaxel by HPLC

1,2

（1. Jiangsu Provincial Xuzhou Pharmaceutical Vocational College, Jiangsu Xuzhou 221116, China；2. Jiangsu Aosaikang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Jiangsu Nanjing 211112, China）

: To establish a method for determination of the related substances in Cabazitaxel.:The column was Shimpack VP-ODS, with the mobile phase A of methanol- acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution (20:30:50),and the mobile phase B of methanol- acetonitrile（40：60）.The linearity gradient elution: 0-25 min，mobile B 20%~30%；25-40 min，mobile B 30%~80%；40-50min,mobile B 80%；50-60 min,mobile B 80%~20%.The flow rate was 1.0mL/min, the column temperature was 25 ℃, the detection wavelength was 230 nm.: The liner range of calibration curve for related substances was 0.05~5.0 g/mL(≥ 0.999),the resolution was good between degradation and Cabazitaxel,and the solution was stable within 8 h,and the RSDs of precision and repeatability were less than 5.0%(= 6),the recovery of related substances was 86.04%~118.9% (RSD<8.4%,= 9).: The method is simple, rapid, accurate, sensitive, and suitable for determination of the related substances in Cabazitaxel..

high performance liquid chromatography (HPLC) ; Cabazitaxel; related substances

2017-12-01

趙迎春（1979-），女，講師，工學(xué)碩士，江蘇省徐州市人，2009年畢業(yè)于南京工業(yè)大學(xué)生物化工專業(yè)，研究方向：藥學(xué)。

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A

1004-0935（2017）12-1225-04