基于新型納米團簇熒光共振能量轉移體系的構建及其在葡萄糖檢測中的應用

劉存弟, 林大杰

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基于新型納米團簇熒光共振能量轉移體系的構建及其在葡萄糖檢測中的應用

劉存弟, 林大杰

（溫州大學 化學與材料工程學院，浙江 溫州 325035）

通過合成生物兼容性優異的新型納米團簇，如碳、銅納米團簇，并構建了熒光共振能量轉移（FRET）體系，以此來對葡萄糖進行高靈敏、高選擇性的檢測。通過熒光光譜分析儀、透射電子顯微鏡和紅外光譜等進行表征。在最優條件下，系統熒光強度隨葡萄糖濃度的增加呈線性增強，線性范圍是9 ~54 μM，檢測限是6.39 μM。該探針具有較高的靈敏度和選擇性。

關熒光；葡萄糖；碳量子點；銅納米簇

在自然界中眾多的生物化合物中，葡萄糖是我們日常生活中比較重要的物質之一。而且糖尿病也與葡萄糖有著密切的聯系。人體血糖濃度與正常值的比較是判斷高血糖癥狀的標準，正常的血糖濃度范圍有兩種情況，一種是空腹（3.9~6.2 mM），另一種是飯后2 h（3.9~7.8 mM）。糖尿病還可以引起一些其他疾病，比如腎衰竭、心臟病和失明[1, 2]。因此，葡萄糖的定量檢測在很多領域都具有非常重要的意義，包括從生物醫學應用到生態方面等諸多領域[3]。因此，不管是醫學上還是科研領域都迫切需要對葡萄糖的檢測方法進行研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

實驗中所用的溶劑全部為超純水Milli-Q(≧18 MΩ)，是由超純水系統(Millipore, Biocel)制備的。用到的所有試劑有苯硼酸、苯硼酸、二水合氯化銅、硼氫化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、3-巰基-1，2-丙二醇、葡萄糖蔗糖、D-(+)-半乳糖、D-果糖、麥芽糖、β-乳糖均購于上海阿拉丁試劑有限公司。

主要儀器有F-7000熒光光譜儀（日本日立公司），Avatar 360紅外分光光譜儀（美國尼高力儀器公司），JEM-2100F透射電子顯微鏡TEM（日本電子），SES 2002 X射線光電子能譜儀XPS(日本島津公司)。

1.2 納米材料的合成及功能化

1.2.1 硼酸功能化的碳量子點(C-dots)的合成

根據文獻用苯硼酸一步自身還原合成碳量子點的方法[4]，將0.2 g苯硼酸溶于20 mL去離子水中，室溫攪拌10 min，然后逐滴攪拌加入NaOH溶液使pH=9，當溶液變得澄清后全部轉移到反應釜內膽中，放入烘箱中160 ℃自身還原8 h，然后冷卻至室溫，用超濾管在10 000 r/min下離心20 min除去未反應的苯硼酸，再用去離子水清洗2~3次，在超濾管的底部得到了硼酸功能化的碳量子點(C-dots)，保存在-4 ℃的冰箱中待用。

1.2.2 3-巰基-1，2-丙二醇(MG)功能化的銅納米簇（CuNCs）的合成[5]

0.037 g無水氯化銅溶于20 mL去離子水中，加入過量的3-巰基-1，2-丙二醇做保護劑，室溫攪拌5 min，形成黃色凝膠溶液，然后逐滴攪拌加入NaOH溶液使溶液變澄清，約10 min后加入適量新配制的硼氫化鈉溶液作為還原劑還原銅鹽，然后將溶液全部轉移到反應釜中內膽中，放入烘箱中120℃反應5 h，然后冷卻至室溫，用超濾管在10 000 r/min下離心20 min除去未反應的保護劑和多余的氫氧化鈉，再用去離子水清洗2~3次，在超濾管的底部得到了3-巰基-1，2-丙二醇功能化的銅納米簇（CuNCs），保存在-4 ℃的冰箱中待用[6]。

2 性能與表征

2.1 硼酸功能化的碳點(C-dots)的表征

2.1.1 透射電子顯微鏡（TEM）

通過透射電子顯微鏡（TEM）來觀察C-dots的形貌特征和尺寸大小。如圖1所示，a圖是所合成的碳量子點的整體分散情況，分布很均勻，形貌為球形，直徑大小范圍從2.5 nm到4.5 nm，平均直徑大約是4 nm左右；b圖是碳量子點局部放大圖，可以看到納米材料的晶格常數是0.23 nm；c圖是碳量子點中加入銅納米簇后發生熒光共振能量轉移的透射電鏡圖，由于銅納米簇的加入拉近了碳量子點之間的距離，圖中看出材料之間發生了團聚；d圖是在c圖的基礎上再加入葡萄糖破壞了熒光共振能量轉移體系，碳量子點之間的距離加大，團聚現象也隨之減弱。

圖1 透射電鏡圖（TEM）

（a）碳量子點整體圖；（b）碳量子點局部圖；（c）向碳量子點中加入銅納米簇發生熒光共振能量轉移；（d）向c中加入葡萄糖

2.2 實驗機理

本實驗基于納米材料之間可以建立熒光共振能量轉移（FRET）體系的原理，建立了一種銅納米簇（CuNCs）猝滅碳量子點(C-dots)的新型納米熒光探針實現對葡萄糖定量檢測的新方法。碳量子點(C-dots)具有良好的光學性質及高的量子產率，因此可以作為FRET體系中一種理想的供體；同時，由于銅納米簇（CuNCs）具有高的消光系數，可以作為FRET中一種良好的熒光猝滅劑。根據硼酸鍵與鄰二醇可以可逆結合的原理，將3-巰基-1，2-丙二醇功能化的銅納米簇（CuNCs）靠近硼酸功能化的碳量子點（C-dots）并且達到了FRET發生的距離范圍之內，從而產生了高效率的FRET。將一定量的碳量子點（C-dots）和不同濃度的銅納米簇（CuNCs）混合特異性結合發生能量共振轉移，使碳量子點熒光猝滅，找到適合測定葡萄糖濃度的平臺，當葡萄糖存在時，葡萄糖與巰基甘油競爭同硼酸的結合位點，使得FRET的效率降低，在一定可控范圍里表現為熒光峰發射位置不變而吸收強度變化，隨葡萄糖濃度的增加碳量子點（C-dots）的熒光強度逐漸恢復。從而可通過對熒光峰的強度變化的分析定量測定葡萄糖的濃度，實現葡萄糖的高選擇性檢測。

2.3 傳感器性能測試

2.3.1 熒光共振能量轉移(FRET)體系的構建

根據之前的實驗步驟在20 μL碳量子點中加100 μL PBS (pH=7.4，0.2M)和不同量的3-巰基-1，2-丙二醇功能化的銅納米簇(0、20、60、100、140、180、220、260、100 μL)，然后用去離子水均稀釋至1 mL，室溫孵化半小時，以碳量子點的熒光為熒光源來測熒光，如圖2所示，隨著銅納米簇加入的量的增加，熒光強度逐漸降低，當銅納米簇的量為260 μL和300 μL時熒光強度幾乎重合，不能再降低，故選擇銅納米簇300 μL作為測定葡萄糖的平臺。

圖2 不同體積的銅納米簇（CuNCs）對FRET體系熒光強度的影響

2.3.2 定量測定葡萄糖

根據之前選出的測定葡萄糖的平臺構建葡萄糖熒光傳感器，由圖3所示，在所構建的熒光共振能量轉移體系的基礎上分別加入不同濃度的葡萄糖(0、9、18、27、36、54 μM)，然后均用去離子水稀釋至1.3 mL，室溫孵化60 min后測熒光。

(a)圖中顯示，隨著葡萄糖濃度的增加熒光強度也隨著增強，但是幅度不是很大，因為葡萄糖與苯硼酸的結合能力大于3-巰基-1，2-丙二醇功能化的銅納米簇，故通過競爭反應使C-dots與CuNCs的距離變大，不滿足FRET的發生所需要的條件，C-dots熒光恢復，但還有部分CuNCs與C-dots結合，所以熒光不能全部恢復。

(b)圖是在完全相同的條件下進行了三次實驗所得到的測定葡萄糖的校準圖，圖中展現了熒光強度與葡萄糖濃度在范圍9~54 μM內有很好的線性關系，線性回歸方程是=2.11×Cglucose(μM)+232.02，相關系數是2=0.988。根據LOD=3/的比值（是被測分析物濃度最小時的背景信號標準偏差，是目標分析物濃度與熒光強度間線性關系式的斜率），可以推算出本實驗設計的傳感器的檢測限為6.39 μM。

圖3 應用本實驗所設計的方法在熒光共振能量轉移體系中監測葡萄糖(0、9 、18 、27、36、54 μM)

2.4 傳感器選擇性測試

本文論述的生物傳感器加入其他干擾糖類，如果糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖和β-乳糖，監測產生的熒光強度恢復程度。36 μM的各種糖類及葡萄糖分別加入相同條件下構建的生物傳感器中。

圖4 生物傳感器的選擇性（葡萄糖和其他糖類的濃度均是36 μM）

如圖4所示，其他干擾糖類在相同濃度下對生物傳感器的熒光強度恢復甚微，只有葡萄糖和麥芽糖對生物傳感器熒光強度有一定的恢復，說明生物傳感器對葡萄糖有一定的選擇性，而麥芽糖在水溶液中會水解生成葡萄糖，故對本實驗的傳感器也有一定的響應。由此可得出的結論是本文論述的熒光生物傳感器對葡萄糖有較強的選擇性。

3 結果與討論

本章實驗制備的熒光葡萄糖傳感器結合了納米材料之間的熒光共振能量轉移(FRET)技術和硼酸酯鍵與鄰二醇的特異性可逆結合以及葡萄糖的競爭反應。該方法展示了比較寬的檢測范圍和比較好的檢出限。此外，本文論述的傳感器根據其他的二塘類或者多糖類的水解產生葡萄糖相互作用，可用于定量檢測其他二塘類或者多糖類生物分子。

[1] Li Y, Zhong Y, Zhang Y, et al. Carbon quantum dots/octahedral Cu 2 O nanocomposites for non-enzymatic glucose and hydrogen peroxide amperometric sensor[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2015, 206(3): 735-743.

[2] 吳忠玉, 方浩, 徐文方. 基于有機硼酸的葡萄糖熒光傳感器的研究進展[J]. 有機化學, 2007, 27(7): 830-836.

[3] Chen Z, Li Q, Wang X, et al. Potent method for the simultaneous determination of glutathione and hydrogen peroxide in mitochondrial compartments of apoptotic cells with microchip electrophoresis-laser induced fluorescence[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(5): 2006-2012.

[4] Shen P, Xia Y. Synthesis-modification integration: one-step fabrication of boronic acid functionalized carbon dots for fluorescent blood sugar sensing[J]. Anal Chem, 2014, 86(11): 5323-5329.

[5] 余明明, 劉東志, 李巍, 等. 巰基丙酸保護的納米銀制備及熱分解行為研究[J]. 化學工業與工程, 2015, 32(6).

[6] Tang Y, Yang Q, Wu T, et al. Fluorescence enhancement of cadmium selenide quantum dots assembled on silver nanoparticles and its application to glucose detection[J]. Langmuir, 2014, 30(22): 6324-6330.

Construction of Fluorescence Resonance Energy Transfer System Based on Novel Nanoclusters and Its Application in Glucose Detection

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（Wenzhou University, Zhejiang Wenzhou 325035，China）

A new type of nano clusters with excellent biocompatibility was synthesized, such as carbon, copper nanoclusters;and the fluorescence resonance energy transfer (FRET) system was constructed in order to detect glucose. The system was characterized by fluorescence spectroscopy, transmission electron microscopy and infrared spectroscopy. The results show that, under optimized experimental conditions, the fluorescence intensity increases linearly with the increase of glucose concentration in the range of 9 ~54 μM, and the detection limit is 9 μM. The probe has high sensitivity and selectivity.

fluorescence; glucose; C-dots; CuNCs

2016-03-20

劉存弟（1989-），女，碩士，山西省忻州市人，2017年畢業于溫州大學化學專業，研究方向：分析化學。

林大杰（1978-），男，副教授，博士，研究方向：分析化學。

TQ 028

A

1004-0935（2017）05-0423-03