一株產(chǎn)香蘭素的海洋放線菌的篩選及發(fā)酵條件的研究

趙希景

摘 要：本文以漳州古雷半島潮間帶沉積物作為研究對象，篩選出能夠發(fā)酵代謝產(chǎn)香蘭素的高產(chǎn)菌株。為海洋放線菌發(fā)酵代謝進入工業(yè)化生產(chǎn)做出理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：古雷半島潮間帶；香蘭素；阿魏酸

中圖分類號：TQ920 文獻標識碼：A

0.引言

香蘭又名香草醛，香草素等，其化學(xué)名稱為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，分子量為152.16，熔點81℃～83℃。具有香莢蘭的香氣以及濃郁的奶香，是人們所喜愛的奶油香草精的主要成分，為香料工業(yè)中最大的品種。因此其用途十分廣泛具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。本文研究從古雷半島潮間帶中分離得到了45株海洋放線菌，其中可以利用阿魏酸轉(zhuǎn)化生成香蘭素的菌株有8株；對該8株海洋放線菌進行阿魏酸耐受性的篩選獲得了一株可以高產(chǎn)香蘭素的優(yōu)秀菌株；對其發(fā)酵條件的初步研究表明在溫度為35℃，pH為8.5，裝液量為100mL/500mL時發(fā)酵單位最高可達到11.2g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達到75%以上。這對于海洋資源的開發(fā)，以及微生物轉(zhuǎn)化法生成香蘭素提供了重要的理論依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 樣品采集

樣品采集自漳州古雷半島潮間帶沉積物，去掉表層約10cm，使用預(yù)先備好的無菌樣品勺采集10cm～20cm深處的沉積物樣品1份，放入無菌三角瓶中，封口后放于冰盒中封存并帶回實驗室進行研究。

1.2 培養(yǎng)基

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，Nacl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂15g～25g，水1000mL，pH7.4～7.6。

放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨3.0g，酵母浸粉3.0g，葡萄糖20g，阿魏酸1.0g，海水100mL，定容至1000mL，初始pH為7.0～7.5，發(fā)酵pH為8.0～8.5。

菌種保藏培養(yǎng)基：酵母浸粉3.0g，蛋白胨3.0g，瓊脂粉15g～25g，海水100mL，定容至1000L，pH7.0～7.5。

1.3 樣品預(yù)處理

將1g樣品在55℃水浴中加熱5min；處理好后將沉積物樣品使用式溶液使用1/4林格式溶液進行稀釋。將稀釋后的沉積物采用含有10%濃度海水的無菌水進行梯度稀釋；采用平板涂布法將其涂布在含有10%海水的高氏一號培養(yǎng)基中，其中在培養(yǎng)基中添加千分之五的氨芐青霉素來抑制細菌的生長，同時還需添加濃度為0.1g/mL的制霉菌素溶液用來抑制霉菌等真菌的生長。28℃培養(yǎng)48h。

1.4 放線菌菌株分離與純化

將在高氏一號培養(yǎng)基中長出的菌體，按照菌落大小，菌體形態(tài)，顏色等的不同挑選單菌落，采用點植法再次接種在含有10%海水的高氏一號培養(yǎng)基中。倒置培養(yǎng)與28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h。繼續(xù)挑選單菌落采用點植法進行接種，重復(fù)劃線；重復(fù)上述步驟2～3次。將純化后的菌株使用保藏培養(yǎng)基進行保藏待用。

1.5 目標菌株的篩選

將分離得到的純菌株培養(yǎng)至250mL茄子瓶中，培養(yǎng)28h后使用無菌水將菌體洗下，搖勻待用；取1mL菌懸液接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中于28℃180rpm搖床中培養(yǎng)28h。28h后將搖瓶取出12000rpm離心3min，取上清液過0.22μm水膜成為待測樣品。

1.6 香蘭素含量的測定

采用液相檢測方法進行檢測；檢測條件為——柱子型號）色譜柱，流動相為A，B為0.1%磷酸緩沖液：甲醇（Av/Bv）=55∶45，流速為0.8mL/min，柱溫30℃，檢測波長為280nm紫外檢測，進樣量為0.5μL。

2.結(jié)果與分析

2.1 海洋放線菌的分離純化

采用不同方式處理沉積物樣品對樣品分離放線菌的效果具有較大的影響，同時，取樣的時間、地點以及海水的深度等外界條件對放線菌獲得種類，數(shù)量均有較大的影響。據(jù)報道，采用通過55℃水浴6min處理樣品可以獲得最大數(shù)量的放線菌。本研究采用該種方法供分離得到了放線菌菌株45株。

2.2 產(chǎn)香蘭素菌株的篩選

2.2.1 液相檢測標準曲線的制作

使用香蘭素，阿魏酸的標準品配置一定梯度濃度的標準溶液，使用香蘭素液相的檢測方法進樣，檢測出不同梯度濃度的香蘭素和阿魏酸的標準曲線；香蘭素的線性回歸方程為Y=15479x-2.915，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，阿魏酸的線性回歸方程為Y=19393x-25.65，相關(guān)系數(shù)R2=0.999；均具有較好的線性關(guān)系。

2.2.2 目標菌株的篩選

將分離得到的45株放線菌進行搖瓶發(fā)酵，48h檢測發(fā)酵液中香蘭素的含量，其結(jié)果見表1。

從表1所示，我們可以看出初篩所得到的45株菌株中僅有8株菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過程中產(chǎn)出香蘭素；其中，菌株B-32產(chǎn)量最高，在含有阿魏酸1g/L的發(fā)酵液中可轉(zhuǎn)化生成香蘭素0.71g/L。其菌體濃度可達到OD620為0.21。菌株B-7，B-16，B-22，B-25，B-28，B-38，B-44在該發(fā)酵培養(yǎng)中也可以轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素，其香蘭素的摩爾轉(zhuǎn)化率均在70%以上。從表中我們可以看出菌株B-4，B-13，B-34，B-41該4株菌株在發(fā)酵液中均可以生長，通過液相檢測其中阿魏酸的含量明顯減少，但是未發(fā)現(xiàn)有香蘭素的生成。可能是由于在發(fā)酵過程中這4種菌可以利用阿魏酸產(chǎn)生其他類的代謝產(chǎn)物，值得我們拿出進行系統(tǒng)的研究。

結(jié)論

本研究從漳州古雷半島潮間帶沉積物中篩選出45株海洋放線菌，通過對45株放線菌進行篩選獲得一株香蘭素的高產(chǎn)菌株B-32；并對發(fā)酵條件進行初步的研究：在溫度為35℃，pH為8.5，裝液量為100mL/500mL條件下，可轉(zhuǎn)化生成11.6g/L香蘭素，轉(zhuǎn)化率達到75%以上；這對于通過微生物轉(zhuǎn)化方式生產(chǎn)天然香蘭素提供了重要的理論依據(jù)。目前，對于菌株B-32發(fā)酵產(chǎn)香蘭素的發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化，諸如碳源，氮源等正在進行中。

參考文獻

[1]陳曉菲，高向東，顧覺奮.海洋放線菌及其產(chǎn)物的多樣性[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2013（1）：1-5.