免疫檢測技術在中藥質量快速評價中的應用

張波+南鐵貴+孫晴+劉洪美+丁鳳偉+王穎

[摘要]中藥質量評價分為有效性和安全性2個方面，現有的中藥質量評價方法以儀器檢測方法居多，不能滿足生產及生活中簡單、快速、現場化的實際需求。免疫檢測技術具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、檢測快速、檢測成本低、儀器依賴性低、易于現場化等優點，在臨床檢驗、食品安全檢測及環境污染監測等領域應用廣泛。近些年來，免疫檢測技術逐漸應用于中藥質量控制領域，涉及中藥有效成分的定量檢測，中藥有害物質檢測，中藥外源性污染物檢測等方面。該文綜述了應用較廣的酶聯免疫檢測法和膠體金免疫檢測試紙條技術的原理及在中藥質量評價中的應用，該技術在中藥質量現場快速檢測中具有較好應用前景。

[關鍵詞]質量評價； 快速檢測； 酶聯免疫檢測； 膠體金免疫檢測試紙條

[Abstract]The quality evaluation of traditional Chinese medicine can be divided into two aspects， effectiveness and safety. The existing methods for evaluating the quality of traditional Chinese medicine（TCM） are mostly based on the testing instruments， which can not meet the practical needs of simple， rapid and on-site in production and life. Immunoassay， characterized by simple， rapid， sensitive， specific， low-cost and high-throughput， is widely used in the fields of clinical diagnosis， environmental pollution monitoring， food safety testing， and other fields. In recent years， immunoassay technology has been gradually applied in the field of quality control of TCM， involving quantitative detection of effective components of TCM， detection of harmful substances in TCM， and detection of exogenous pollutants in TCM. This paper summarizes the principle of the wide application of ELISA and colloidal gold immunostrip technology and its application in quality evaluation of TCM， this technique has a good application prospect in the field of rapid detection of the quality of TCM. In this paper， the principles of the widely used ELISA and colloidal gold immune test strip technology as well as their application in quality evaluation of TCM were reviewed， and the results showed that this technique had a good application prospect in the field of rapid detection of the quality of TCM.

[Key words]quality evaluation； fast detection； ELISA； colloidal gold immune test strip

中藥有效性和安全性是中藥質量評價的2個重要標準。化學成分是中藥發揮療效的物質基礎，其中又以指標性成分的含量高低作為中藥質量控制及品質優劣評價的重要指標。近些年來，隨著中藥野生資源的大量減少，及基于對中藥質量穩定性和可控性的需求，中藥栽培品逐漸成為中藥市場的主要來源。在中藥的栽培管理過程中，農藥的大量使用導致農殘偏高，加上栽培環境污染或加工方法不當引起的重金屬超標；存儲不當引起的細菌、真菌污染以及中藥中自身存在的有毒、有害物質均影響到中藥的用藥安全。

隨著中藥質量標準和消費者健康安全意識的提高，無論是生產者還是消費者都希望獲得一種簡單、快速、高通量、現場化的檢測方法來評價所用中藥的質量及安全性。目前，針對中藥材的質量和安全性評價應用最多的仍是基于儀器分析的技術手段，如高效液相色譜、氣相色譜、質譜、色譜-質譜聯用技術等。儀器分析具有靈敏度高、精密度高、重現性好、易于標準化等優點，但無法滿足簡單、快速檢測的要求。免疫檢測技術是基于抗原與抗體的特異性反應而建立的，對抗原或抗體實現定性定量檢測的方法。免疫檢測技術具有樣品用量小，操作簡單，檢測快速，檢測成本低廉，高通量及易于現場化等優點。目前在中藥研究領域中應用最多的免疫檢測方法有適用于高通量快速定量檢測的酶聯免疫檢測吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）以及適用于現場快速檢測的免疫膠體金試紙條技術（gold immunochromatography assay，GICA）。

1 免疫檢測技術

1.1 抗原

中藥成分種類繁多，根據化合物相對分子質量大小通常可分為2類，一是大分子物質，如蛋白質、氨基酸、多糖類（淀粉、纖維素、植物凝集素等）；另一類是小分子物質（相對分子質量小于5 000），如黃酮類、有機酸類、生物堿類、皂苷類、萜類、蒽醌類物質等。從免疫學的角度來講，大分子物質既具有免疫原性又具有反應原性，屬于完全抗原，而小分子物質只具有反應原性而不具有免疫原性，無法刺激動物產生免疫應答，屬于半抗原。中藥中小分子物質占到90%以上，為了制備抗體和建立相應的免疫檢測方法，需要將小分子物質與蛋白質載體相結合制備成完全抗原。人工抗原的合成方法主要是基于小分子化合物的活性基團來選擇，如針對羧基多采用碳二亞胺法、活潑酯法、琥珀酸酐法；氨基多采用戊二醛法；糖基可采用高碘酸鈉法；酚羥基可采用混合酸酐法；芳香氨基采用重氮化法等。廖國平^[1]、趙寧毅^[2]等對中藥成分半抗原的制備方法、原則、佐劑和載體的選擇以及完全抗原的鑒定方法等均做了詳細介紹。

1.2 抗體

根據抗體的來源及應用不同，可將抗體分為多克隆抗體（pAb）、單克隆抗體（mAb）、基因工程抗體3種。多克隆抗體通常是從致敏后的動物血液中分離血清直接使用，或進一步純化后得到，但仍有較多雜蛋白。單克隆抗體是指由一個B細胞分泌的，性質均一、靈敏度高、特異性強的抗體，通過雜交瘤細胞技術獲得。基因工程抗體是指利用重組DNA及蛋白質工程技術對編碼抗體的基因按不同需要進行加工改造和重新裝配，轉染適當受體細胞后表達的重組抗體分子。目前，在中藥研究領域中以多克隆抗體和單克隆抗體應用較多。多克隆抗體制備周期短，獲取方法簡單，但抗體的性質不均一，批次間差異明顯，抗原消耗量大。相比之下，單克隆抗體則靈敏度高、特異性強、性質均一且可以大量制備，是抗體制備的主流趨勢。

2 ELISA在中藥質量快速評價中的應用

ELISA是一種將抗原抗體的特異性結合反應與酶的高效催化反應相結合，從而實現對抗原或抗體的定性定量檢測的方法。ELISA是一種固相檢測方法，在中藥有效成分的檢測中以檢測小分子化合物的間接競爭法應用最為廣泛，其基本原理見圖1。

2.1 ELISA在中藥品質優劣評價中的應用

中藥的品質評價既包括真偽鑒定也包括品質優劣評價。ELISA用于藥材真偽鑒定可通過特異性物質的有無來判斷，屬于化學鑒定范疇，但由于尋找真偽鑒定特異性物質難度很大，因此ELISA在藥材基原鑒別中的研究及應用較少。品質優劣評價多是檢測質量控制指標性成分的含量高低，屬于定量檢測。ELISA檢測技術具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高、高通量等優點，彌補了HPLC檢測技術的不足，為藥典中指標性成分的快速檢測提供了補充。ELISA的技術優勢使藥材監管更加方便快捷，馬麗玲等^[3]利用ELISA檢測方法，對10份廣州市售柴胡藥材中的柴胡皂苷A進行含量測定，發現其中3份樣品不合格，整個檢測過程僅需2 h，較HPLC大大提高了檢測效率。Zhang等^[4]通過建立的木犀草苷ELISA檢測方法，可有效區分山銀花與金銀花中木犀草苷的含量高低。目前，已有10多味中藥材，20多種化學成分的抗體及ELISA檢測方法的報道，其化學成分種類及相應的檢測范圍信息見表1。

2.2 ELISA在中藥安全性評價中的應用

2.2.1 有毒成分及有害成分 隨著生活質量的提高，消費者對養生中藥的需求量不斷增加，且更關注中藥的安全性。影響中藥安全性的因素主要有中藥內源性的有毒、有害物質和外源性的農藥殘留、重金屬污染、染色劑污染及真菌毒素污染等。有毒物質本身也是有效物質，但是如果存在不合理用藥便會對人體造成傷害，如馬錢子中的番木鱉堿；烏頭中的烏頭堿類成分等。Kido等^[27]制備了烏頭堿類成分的單克隆抗體，并建立了ELISA檢測方法，其檢測范圍為100～1 500 mg·L^-1，該方法應用于烏頭中烏頭堿的檢測與HPLC檢測結果相關系數在0.9以上，為川烏的質量控制及臨床安全用藥提供了新的檢測方法。有害物質是指與藥物治療效果無關的，對人體有害的一類物質，如細辛和天仙藤中的馬兜鈴酸A。南鐵貴等^[11]通過碳二亞胺法合成了馬兜鈴酸A的完全抗原并制備了抗馬兜鈴酸A的單克隆抗體，所建立的ELISA檢測方法IC₅₀為1.9 mg·L^-1，通過ELISA檢測馬兜鈴酸A含量可有效區分木通與川木通。

2.2.2 真菌毒素類 中藥在生產、儲存等過程中易產生一些真菌毒素，如黃曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素、T-2毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、桔青霉素、展青霉素等，對人體具有毒性，需加強控制。2015年版《中國藥典》對19種中藥中的AF含量做了明確限定，即每1 kg中藥含AFB₁不得過5 μg，AFB₁，AFB₂，AFG₁和AFG₂的總量不得過10 μg，對其他毒素尚未做出明確限量規定。高效液相色譜法和液質聯用技術具有專屬性較強，重復性較好，假陽性率較低，可以實現多成分同時檢測等優點，被選為藥典AF檢測的指導方法。

ELISA憑借其具有高靈敏度，高特異性和適宜大批樣品集中檢測等優勢在中藥AF檢測中應用較廣。梁月秋等^[31]利用ELISA檢測了37種中藥材和22批中成藥AFB₁污染情況，結果中藥材和中成藥的AFB₁污染比例分別達到了92%，86%。李汶等^[32]采用同樣方法對30種中藥材和7個品種20多個中成藥樣品進行了AFB₁含量檢測，發現所有樣品均存在不同程度的AFB₁污染，且含量均超過5 μg·kg^-1。果實種子類中藥由于富含油脂，在儲藏過程中易引起真菌污染，張愛婷等^[33]對13種果實種子類中藥的AFB₁含量進行了檢測，結果顯示益智仁和薏苡仁中AFB₁含量超標，ELISA在整個檢測過程中呈現出操作簡單、快速、高通量、適用于復雜基質檢測等優點，檢測效果良好。陳建民等^[34]比較了AF的薄層色譜檢測法、ELISA檢測法和免疫親和柱凈化-高效液相色譜（ICA-HPLC）檢測法，認為ELISA檢測技術可發展成為AF快速檢測技術。但在其研究中發現ELISA檢測結果與ICA-HPLC檢測方法相比AFB₁的檢出量明顯偏高，具體原因可能是ELISA試劑盒所用的抗體存在一定交叉反應，特異性不夠；再者，不同檢測基質差異顯著且成分較為復雜，可能存在一定的基質干擾。因此，制備高親和力高特異性的抗體是ELISA檢測技術的關鍵。部分有關AF抗體總結見表2。

2.2.3 農藥殘留 隨著自然資源的不斷枯竭及中藥需求量的不斷增大，人工栽培品成為中藥市場的主流，尤其是近十多年中藥材規范化生產概念的提出和《中藥材生產質量管理規范（GAP）（試行）》的出臺大大提高了中藥材的栽培種類和栽培面積，郭蘭萍等^[41]系統回顧了中藥材規范化生產10年來的成果、存在的問題，并提出了改進意見。在中藥的栽培過程中，為防治病蟲害及去除雜草，農藥的使用頻率及使用量不斷提高，導致農藥殘留現象普遍存在，嚴重影響中藥材質量。王麗麗等^[42]分析了我國中藥農藥殘留的特點，指出有機氯農藥殘留最多，有機磷和擬除蟲菊酯類農藥次之，氨基甲酸酯類農藥殘留極少。目前，農藥殘留的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、液質聯用技術（LC-MS）、氣質聯用技術（GC-MS）等。ELISA檢測技術憑借其超高的靈敏度（ng-pg級）和高通量檢測的優勢在食品農藥殘留檢測中應用較為廣泛。高宏斌等^[43]綜述了免疫分析技術在擬除蟲菊酯類農殘檢測中的應用；李衛霞^[44]、武中平^[45]等總結了部分國內外關于食品中殺蟲劑、殺菌劑、除草劑和生物調節劑等農藥殘留ELISA檢測技術的文獻報道，均可為中藥材農殘的檢測提供參考。

2.2.4 重金屬 重金屬污染問題嚴重影響了藥材質量，同時威脅到臨床用藥安全，因此我國藥典已對鉛、鎘、砷、汞、銅等5種重金屬含量做了限量規定。藥材生長環境污染、藥材自身富集作用以及生產加工過程中的帶入污染均會引起中藥重金屬污染，吳亞東等^[46]檢測了17種常用中藥材飲片中的5種重金屬含量，17種藥材均存在重金屬超標的現象，且以鎘含量超標尤為突出。2015年版藥典中重金屬的檢測方法采用比色法，此外還有紫外分光光度法、HPLC、電耦合等離子體質譜法、火焰萃取法、原子吸收法、分子熒光法、等離子發射光譜法、免疫檢測法等^[47]。目前，基于特異性抗體的重金屬ELISA檢測方法多用于食品（糧食、蔬菜）檢測及環境監測（土壤、水），在中藥材基質檢測中的應用較少。5種重金屬離子中，以鎘離子研究最為廣泛，砷離子研究最少，見表3。

3 膠體金免疫色譜技術在中藥質量快速評價中的應用

膠體金標記抗體技術是以膠體金顆粒為示蹤標記物或顯色劑，應用于抗原抗體反應的一種新型固相免疫標記技術。發展至今，已廣泛應用于光鏡、電鏡、流式細胞儀、免疫轉印、體外診斷等眾多領域。1962年，Feldherr和Marshall首次介紹了膠體金作為一種電子顯微鏡水平的示蹤標記物；1971年，Faulk等將膠體金引入免疫化學，此后該技術在生物醫學領域應用廣泛；1990年，Beggs等用免疫色譜技術檢測孕婦尿液HCG，實現了早孕診斷的免疫學快速檢測技術，即膠體金免疫色譜法。

3.1 膠體金標記抗體

膠體金是指呈膠體狀態，大小均勻的金顆粒，根據金顆粒大小（1～100 nm）及金濃度不同顯橘紅色至紫紅色。膠體金的制備通常采用化學還原法，基本原理是氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下聚合成一定大小的金顆粒，其表面帶有大量負電荷，產生的靜電排斥力使其在水中保持穩定的膠體狀態，故稱膠體金。在范德華力作用下，膠體金與抗體發生非特異性結合，使抗體呈紅色但并不影響抗體的生物活性。

3.2 膠體金免疫檢測試紙條

GICA是將膠體金標記抗體技術與紙色譜技術相結合的一種定性/半定量檢測方法。免疫色譜試紙條是以硝酸纖維素膜為載體，滴加在膜條一端的待測液體利用微孔膜的毛細管作用慢慢向另一端滲移，在此過程中發生相應的抗原抗體反應并通過膠體金的顏色判定結果。試紙條是膠體金標記技術在免疫色譜中應用的一個重要形式，其組成分為樣品墊、膠體金標記物吸收墊（載有金標抗體）、硝酸纖維素膜和吸水紙。小分子物質檢測原理同ELISA，均為競爭法，見圖2，當在試紙條樣品墊滴入待測提取液后，在毛細管作用下，溶液沿試紙條擴散，至膠金墊時發生抗原抗體特異性結合，至硝酸纖維素膜上包被抗原線（檢測線，T線）時包被抗原與待檢抗原競爭結合金標抗體，至第二抗體（對照線，C線）時，金標抗體與二抗結合。在C線出現紅線的前提下，根據T線是否出現紅色進行判斷。如果樣本中待檢測物質含量大于一定的濃度，T線不顯色，結果為陽性，反之，T線顯紅色，結果為陰性；如果C線不出現紅色，則說明試紙條失效。

3.3 GICA在中藥品質優劣快速評價中的應用

GICA具有靈敏度高、特異性強、樣品處理簡單、輕便易攜帶、檢測快速（檢測時間5～15 min）、檢測成本低、結果肉眼可辨等優點，近10年來逐漸應用于中藥活性成分的半定量檢測，并在中藥現場快速檢測方面具有較好的發展前景。日本學者Putalun團隊較早應用此技術，并先后制備了檢測番瀉苷A和番瀉苷B（檢測限為125 mg·L^-1）^[58]、甘草酸（檢測限250 mg·L^-1）^[59]、人參皂苷Rg₁和人參皂苷Rb₁（檢測限為2 000 mg·L^-1）^[60]、積雪草苷（檢測限12.5 mg·L^-1）^[61]、桑皮苷A（檢測限2 mg·L^-1）^[62]的膠體金免疫檢測試紙條，應用于中藥材及中成藥的檢測。國內研究較少，2006年，Zhao等^[63]制備了甘草酸膠體金免疫色譜試紙條（檢測范圍20～50 mg·L^-1），通過自來水浸泡甘草樣品30 min即可實現甘草酸的半定量檢測，整個過程操作簡便快速。南鐵貴等^[64]在人參皂苷Re單克隆抗體的基礎上，制備了人參皂苷Re膠體金免疫色譜試紙條（檢測限為200 mg·L^-1），自來水浸提人參樣品30 min后，試紙條檢測10 min即可實現人參的真偽優劣鑒定，且鑒定結果與ELISA結果一致，無假陽性或假陰性結果出現。

3.4 GICA在中藥安全性評價中的應用

GICA靈敏度通常在納克及皮克級別，且使用方便，技術水平要求不高，易于推廣，在臨床醫學（獸醫臨床）檢測、食品安全、農獸藥殘留等領域應用廣泛，尤其是食品安全方面的真菌毒素檢測和農藥殘留檢測均可借鑒用于中藥材或中成藥的檢測。楊英等^[65]利用膠體金標記抗AFB₁單克隆抗體，并組裝制備了免疫色譜試紙條用于23份蓮子樣品AFB₁的檢測，其中6份樣品結果呈陽性，所有樣品經UFLC-MS/MS確證后證實試紙條無假陽性和假陰性結果。王宇婷等^[66]就膠體金色譜技術在包括真菌毒素、農藥殘留、重金屬污染、抗生素殘留等外源性有害物質快速檢測中的應用做了詳細介紹。徐超蓮等^[67]總結了膠體金免疫色譜法在食品天然存在的危害物質檢測中的應用研究進展。

4 總結與討論

隨著生活質量的提高，消費者對健康及食品安全關注度越來越高，中藥不僅是治病救人的藥物，同時還以保健品，藥食同源的食材等諸多身份呈現給廣大消費者。由于中藥野生資源的匱乏，環境污染，中藥栽培與生產過程中的帶入污染等因素導致中藥質量屢屢出現問題，因此中藥質量的監測不應僅局限在藥材監管部門和制藥企業，更應該推廣到廣大的消費群體。所以，建立一種操作簡單、使用門檻低、無儀器依賴且易于推廣使用的中藥質量現場快速檢測方法是十分必要的。

ELISA檢測法和GICA檢測法分別作為高通量檢測和現場快速定性/半定量檢測技術在中藥質量控制領域的應用逐步展開，在方法建立過程中應注意以下幾點。①根據中藥質量控制的要求不同建立方法：《中國藥典》中的質量控制指標有些為不同類成分（如金銀花中的綠原酸、木犀草苷），有些為同一類成分總和（如大黃中的蒽醌類成分）。對于綠原酸的含量測定，綠原酸的結構類似物種類多，含量也較高，由于抗體往往存在一定交叉反應，所以對檢測結果會有影響，這就要求抗體的特異性越高越好；對于大黃中的蒽醌類成分，抗體交叉反應高，則可一次完成5種成分的總含量檢測，無需制備各個成分的抗體，減少了成本與檢測時間，所以抗體的特異性不需要太高。②配套提取方法的建立：中藥基質復雜，無關化學成分可能會影響目標成分檢測結果的準確性，加上“快速檢測”的目標需求，建立待檢成分的快速提取方法也是整個快速檢測體系中的關鍵環節。③方法穩定性：免疫檢測方法易受試劑、材料、環境等因素影響，尤其是抗體易失活。如何保證抗體的活性及方法的穩定性是需要亟待解決的問題，也是方法實現大面積推廣的前提。④試紙條定量檢測：目前膠體金試紙條多用于定性、半定量檢測，開發便攜式、微型化、自動化化的試紙條定量檢測儀是未來的發展趨勢。⑤中藥材基原鑒定：基于化學成分的免疫檢測技術在中藥材基源鑒定中較難實現，核酸試紙條可提供一個有效途徑。

免疫檢測技術為中藥質量優劣及安全性評價提供了簡單、快速、高通量、現場化的檢測方法，優勢顯著，應用前景廣闊。

[參考文獻]

[1]廖國平， 汪艷， 陳莉婧， 等. 中藥有效成分半抗原抗體制備技術的研究進展[J]. 中成藥， 2011， 33（6）： 1025.

[2]趙寧毅， 張婷. 中藥小分子化合物人工抗原的制備及鑒定[J]. 時珍國醫國藥， 2012， 2（7）： 1740.

[3]馬麗玲， 譚銘銘， 晁志. 用ELISA法檢驗柴胡藥材的質量[J]. 南方醫科大學學報， 2011， 31（6）： 1006.

[4]Zhang B， Nan T G， Zhan Z L， et al. Development of a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for luteoloside detection in Flos Lonicerae Japonicae[J]. Anal Bioanal Chem，2016， 408： 6053.

[5]薛瑾， 屈會化， 孫曄， 等. 綠原酸人工抗原的合成及多克隆抗體的制備[J]. 中草藥， 2014， 45（4）： 480.

[6]Morinaga O， Tanaka H， Shoyama Y. Production of monoclonal antibody against a major purgative component， sennoside A， its characterization and ELISA [J]. The Analyst， 2000， 125（6）： 1109.

[7]Morinaga O， Nakajima S， Tanaka H， et al. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component， sennoside B， their characterization and use in ELISA [J]. Analyst， 2001， 126（8）： 1372.

[8]張波， 袁媛， 黃璐琦， 等. 大黃酸人工抗原合成及免疫原性鑒定[J]. 中國中藥雜志， 2015， 40（8）： 1463.

[9]Kido K， Morinaga O， Shoyama Y， et al. Quick analysis of baicalin in Scutellariae Radix by enzyme-linked immunosorbent assay using a monoclonal antibody [J]. Talanta， 2008， 77（1）： 346.

[10]Shang M Y， Tian M， Tanaka H， et al. Quality control of traditional Chinese medicine by monoclonal antibody method [J]. Curr Drug Discov Technol， 2011， 8： 61.

[11]南鐵貴， 何素平， 譚桂玉， 等. 中藥至腎毒性成分馬兜鈴酸A單抗制備及酶聯免疫分析方法的建立[J]. 分析化學， 2010， 38（8）： 1206.

[12]Zhao J， Li G， Wang B M， et al. Development of a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of glycyrrhizic acid [J]. Anal Bioanal Chem， 2006， 386： 1735.

[13]李剛， 趙靜， 何素平， 等. 甘草酸多克隆抗體的制備及ELISA方法建立[J]. 時珍國醫國藥， 2011， 22（12）： 2956.

[14]He S P， Tan G Y， Li G， et al. Development of a sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the antimalaria active ingredient artemisinin in the Chinese herb Artemisia annua L. [J]. Anal Bioanal Chem， 2009， 393： 1297.

[15]Nan T G， Wu S Q， Zhao H W， et al. Development of a secondary antibody thio-functionalized microcantilever immunosensor and an ELISA for measuring ginsenoside Re content in the herb ginseng [J]. Anal Chem， 2012， 84（10）： 4327.

[16]Tanaka H， Fukuda N， Shoyama Y. Formation of monoclonal antibody against a major ginseng component， ginsenoside Rb₁ and its characterization [J]. Cytotechnology， 1999， 29： 115.

[17]Tanaka H， Fukuda N， Shoyama Y. Eastern blotting and immunoaffinity concentration using monoclonal antibody for ginseng saponins in the field of traditional Chinese medicines [J]. J Agric Food Chem， 2007， 55： 3783.

[18]Joo E J， Ha Y W， Shin H， et al. Generation and characterization of monoclonal antibody to ginsenoside Rg3 [J]. Biol Pharm Bull， 2009， 32（4）： 548.

[19]Nah J J， Sonog J Y， Choi S， et al. Preparation of monoclonal antibody against ginsenoside Rf and its enzyme immunoassay[J]. Biol Pharm Bull， 2000， 23（5）： 523.

[20]Limsuwanchote S， Wungsintaweekul J， Yusakul G， et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R₁， a distinctive saponin from Panax notoginseng， and its application to indirect competitive ELISA [J]. Planta Med， 2014， 80（4）： 337.

[21]Zhu S H， Shimokawa S I， Tanaka H， et al. Development of an assay system for saikosaponin a using anti-saikosaponin a monoclonal antibodies[J]. Biol Pharm Bull， 2004， 27（1）： 66.

[22]Morinaga O， Lu Z， Lin L， et al. Detection of paeoniflorin and albiflorin by immunostaining technique using anti-paeoniflorin monoclonal antibody [J]. Phytochem Anal， 2013， 24： 124.

[23]于生蘭， 歐陽臻， 徐加兵， 等. 黃芪甲苷單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 天然產物研究與開發， 2013， 25（11）： 1568.

[24]Qu H， Zhang G， Li Y， et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications [J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2014， 953/954： 120.

[25]Loungratana P， Tanaka H， Shoyama Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn [J]. Am J Chin Med， 2004， 32（1）： 33.

[26]Kim J S， Tanaka H， Yuan C S， et al. Development of monoclonal antibody against isoquinoline alkaloid coptisine and its application for the screening of medicinal plants [J]. Cytotechnology， 2004， 44： 115.

[27]Kido K， Edakuni K， Morinaga O， et al. An enzyme-linked immunosorbent assay for aconitine-type alkaloids using an anti-aconitine monoclonal antibody [J]. Anal Chim Acta， 2008， 616（1）： 109.

[28]Sakamoto S， Putalun W， Tsuchihashi R， et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） using highly-specific monoclonal antibodies against plumbagin [J]. Anal Chim Acta， 2008， 607： 100.

[29]Qu H， Wang X， Qu B， et al. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for naringin [J]. Anal Chim Acta， 2016， 903： 149.

[30]馮成強， 黃璐琦， 柳川， 等. 蛋白免疫檢測技術在天花粉真偽鑒別中的初步研究[J]. 中國藥學雜志，2005， 40（8）： 574.

[31]梁月秋， 黃榮芳. 中藥污染黃曲霉毒素B₁檢測分析[J]. 中國現代應用藥學， 2000， 17（3）： 224.

[32]李汶， 莊學聰. ELISA法檢測常用中藥黃曲霉毒素B₁[J]. 中國藥事， 2000， 14（2）： 101.

[33]張愛婷， 石延榜， 張振凌， 等. ELISA法測定部分種子和果實類中藥黃曲霉毒素B₁的含量[J]. 醫學研究雜志， 2008， 37（10）： 48.

[34]陳建民， 張雪輝， 楊美華， 等. 中藥中黃曲霉毒素檢測概況[J]. 中草藥， 2006， 37（3）： 464.

[35]Liu B H， Hsu Y T， Lu C C， et al. Detecting aflatoxin B₁ in foods and feeds by using sensitive rapid enzyme-linked immunosorbent assay and gold nanoparticle immunochromatographic strip [J]. Food Control， 2013， 30： 184.

[36]James J， Chu F S. Aflatoxin B₁ dihydrodiol antibody： production and specificity [J]. Appl Environ Microb， 1984， 47（3）： 472.

[37]Zhou Y， Wu J， Yu W， et al. Preparation for aflatoxin B（1）-cationized bovine serum albumin based on Mannich-type reaction [J]. J Immunol Methods， 2007， 328：79.

[38]Zhang X， Feng M， Liu L， et al. Detection of aflatoxins in tea samples based on a class-specific monoclonal antibody [J]. Int J Food Sci Tech， 2013， 48： 1269.

[39]Soukhtanloo M， Talebian E， Golchin M， et al. Production and characterization of monoclonal antibodies against aflatoxin B1 [J]. J Immunoassay Immunochem， 2014， 35： 335.

[40]肖智. 高特異性黃曲霉毒素B₁單克隆抗體的研制[D]. 北京：中國農業科學院， 2010.

[41]郭蘭萍， 張燕， 朱壽東， 等. 中藥材規范化生產（GAP）10年：成果、問題與建議[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（7）： 1143.

[42]王麗麗， 夏會龍. 我國中草藥中農藥殘留的特點[J]. 中草藥， 2007， 38（3）： 471.

[43]高宏斌， 許艇， 李季. 免疫分析方法在擬除蟲菊酯類農藥殘留檢測中的應用進展[J]. 農業環境科學學報， 2006， 25： 425.

[44]李衛霞， 王素娟. ELISA在農藥殘留檢測中的應用與質量控制[J]. 貴州農業科學， 2009， 37（8）： 241.

[45]武中平， 徐春祥， 高巍， 等. 酶聯免疫分析法及其在食品農藥殘留檢測中的應用[J]. 江蘇農業科學， 2007， 70（1）： 198.

[46]吳亞東， 耿偉， 宋玉龍， 等. 17種常用中藥飲片重金屬含量測定[J]. 新疆中醫藥， 2014， 32（4）： 57.

[47]鄭琪， 南鐵貴， 詹志來， 等. 重金屬快速檢測技術在中藥材質量控制中的應用[J]. 藥物分析雜志， 2015， 35（11）： 1873.

[48]Mandappa I M， Ranjini A， Haware D J， et al. Immunoassay for the detection of lead ions in environmental water samples [J]. Int J Environ Anal Chem， 2012， 92 （3）： 334.

[49]楊依錦， 王俊平， 王津， 等. 重金屬鉛酶聯免疫檢測方法的研究[J]. 食品與機械， 2012， 28（3）： 80.

[50]Gao W， Nan T， Tan G， et al. Development of a sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of cadmium ions in water， soil and rape samples [J]. Food Agri Immuno， 2012， 23（1）： 27.

[51]Zhu X X， Xu L N， Lou Y， et al. Preparation of specific monoclonal antibodies（mAbs） against heavy metals： MAbs that recognize chelated caidmium ions [J]. J Agric Food Chem， 2007， 55： 7648.

[52]Liu G， Wang J， Li Z， et al. Development of direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination cadmium residue in farm produce [J]. Appl Biochem Biotechnol， 2009， 159（3）： 708.

[53]Kong T， Hao X Q， Li X B， et al. Preparation of novel monoclonal antibodies against chelated cadmium ions [J]. Biol Trace Elem Res， 2013， 152（1）： 117.

[54]Wang Y Z， Yang H， Pschenitza M， et al. Highly sensitive and specific determination of mercury（Ⅱ） ion in water， food and comestic samples with an ELISA based on a novel monoclonal antibody [J]. Anal Bioanal Chem， 2012， 403： 2519.

[55]方淑兵， 王俊平， 王碩， 等. 重金屬汞酶聯免疫檢測方法的建立[J]. 食品工業科技， 2012， 50（16）： 86.

[56]Kong T， Li X B， Liu G W， et al. Preparation of specific monoclonal antibodies against chelated copper ions [J]. Biol Trace Elem Res， 2012， 145（3）： 388.

[57]Xing C， Hao C， Liu L， et al. A highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for copper（Ⅱ） determination in drinking water [J]. Food Agri Immuno， 2013， 25（3）： 432.

[58]Putalun W， Morinaga O， Tanaka H， et al. Development of a one-step immunochromatographic strip test for the detection of sennosides A and B [J]. Phytochem Anal， 2004， 15： 112.

[59]Putalun W， Tanaka H， Shoyama Y. Rapid detection of glycyrrhizin by immunochromatographic assay [J]. Phytochem Anal， 2005， 16： 370.

[60]Putalun W， Fukuda N， Tanaka H， et al. A one-step immunochromatographic assay for detecting ginsenosides Rb₁ and Rg₁ [J]. Anal Bioanal Chem， 2004， 378（5）： 1338.

[61]Sritularak B， Juengwatanatrakul T， Putalun W， et al. A rapid one-step immunochromatographic assay for the detection of asiaticoside [J]. J Nat Med， 2012， 66（2）： 279.

[62]Inyai C， Komaikul J， Kitisripanya T， et al. Development of a rapid immunochromatographic strip test for the detection of mulberroside A [J]. Phytochem Anal， 2015， 26（6）： 423.

[63]Zhao J， He S P， Liu W， et al. Development of a lateral flow dipstick immunoassay for the rapid detection of glycyrrhizic acid [J]. Food Agric Immunol， 2006， 17（3/4）： 173.

[64]南鐵貴， 曹振， 何麗珊， 等. 人參皂苷Re膠體金免疫檢測試紙條的制備與應用[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（16）： 2586.

[65]楊英， 謝艷君， 孔維軍， 等. 基于側流免疫色譜技術制備膠體金試紙條檢測蓮子中黃曲霉毒素B₁的研究[J]. 中南藥學， 2015， 13（3）： 246.

[66]王宇婷， 孔維軍， 楊美華， 等. 膠體金色譜技術及其在外源性有害殘留物快速檢測方面的應用進展[J].中國藥學雜志， 2014， 49（19）： 1682.

[67]徐超蓮， 賴衛華， 劉道峰. 膠體金免疫色譜法檢測食品中天然存在的危害物質的研究進展[J]. 食品科學， 2014， 35（5）： 257.

[責任編輯 孔晶晶]