胡椒堿對HepG2細胞胰島素抵抗模型糖代謝AMPK信號通路上游靶點干預機制的研究

萬春平+魏雅改+李曉雪+張麗君+楊瑞+包照日格圖

[摘要]探討胡椒堿對胰島素抵抗（insulin resistance，IR）細胞模型糖代謝紊亂的作用及干預AMPK信號通路上游靶點的分子機制。通過脂肪乳誘導HepG2細胞構建胰島素抵抗模型。葡萄糖氧化酶（GOD-POD）法檢測各組葡萄糖消耗量；酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測上清液中脂聯素（adiponectin，APN）、瘦素（leptin，LEP）的水平；熒光定量 PCR法檢測APN，LEP mRNA的表達水平，Western blotting法檢測AMPKα，р-AMPKα，瘦素受體（LepR），脂聯素受體1（AdipoR1）和脂聯素受體2（AdipoR2）蛋白的表達。結果顯示，胡椒堿與降糖藥羅格列酮、AMPK激動劑AICAR均能明顯提高胰島素抵抗細胞模型的葡萄糖消耗量，升高脂聯素水平、增加脂聯素mRNA、脂聯素受體1蛋白的表達，也增加AMPKα mRNA和р-AMPKα蛋白表達；同時降低瘦素mRNA和瘦素受體蛋白的表達。結果表明，胡椒堿能顯著改善胰島素抵抗細胞模型糖代謝紊亂，其作用機制可能通過調控上游脂聯素和瘦素的表達，從而激活AMPK信號通路。

[關鍵詞]胡椒堿； 磷酸腺苷激活的蛋白激酶； 胰島素抵抗； 瘦素； 脂聯素

[Abstract]To investigate the effect of piperine on the disorder of glucose metabolism in the cell model with insulin resistance （IR） and explore the molecules mechanism on intervening the upstream target of AMPK signaling pathway. The insulin resistance models in HepG2 cells were established by fat emulsion stimulation. Then glucose consumption in culture supernatant was detected by GOD-POD method. Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to measure the levels of leptin（LEP） and adiponectin（APN） in culture supernatant； Real-time quantitative PCR was used to assess the mRNA expression of APN and LEP； and the protein expression levels of LepR， AdipoR1， AdipoR2 and the activation of AMPK signaling pathway were detected by Western blot analysis. The results showed that piperine， rosiglitazone and AMPK agonist AICAR could significantly elevate the glucose consumption in insulin resistance cell models， enhance the level of APN， promote APN mRNA transcripts and increase the protein expression of Adipo receptor. Meanwhile，AMPKα mRNA and р-AMPKα protein expressions were also increased in piperine treated cells， but both LEP mRNA expression and LepR protein expressions were decreased in piperine treated group. The results indicated that piperine could significantly ameliorate the glucose metabolism disorder in insulin resistance cell models through regulating upstream molecules （APN and LEP） of AMPK signaling pathway， and thus activate the AMPK signaling pathway.

[Key words]piperine； AMPK signaling pathway； insulin resistance； leptin； adiponectin

胰島素抵抗是2型糖尿病、高血壓和冠心病的生理病理基礎^[1]。主要表現為胰島素敏感性降低，不能促進外周靶組織（脂肪組織、肝臟、骨骼肌）的葡萄糖攝取和利用^[1]。因此，改善胰島素抵抗是治療糖尿病和相關并發癥的有效干預措施^[2]。AMPK在各組織中分布廣泛，是細胞內主要的“能量感受器”，對代謝穩態起著總開關的作用。AMPK調節異常與胰島素抵抗密切相關^[3]。

胡椒堿（piperine，PIP）是胡椒科植物如胡椒、蓽茇等植物中一種生物活性較強的生物堿。本課題前期實驗研究已證明，不同濃度的蓽茇醇提物及有效成分胡椒堿可顯著降低IR模型大鼠的FBS水平、血清FFA、血壓升高和改善糖耐量異常現象、增強胰島素敏感指數等關鍵指標的病理性變化、改善IR模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α和瘦素水平異常升高^[4-7]。然而其干預作用靶點尚未明確，需進一步研究。本研究進一步在脂肪乳誘導HepG2細胞構建胰島素抵抗模型上，探討胡椒堿對AMPK信號通路上游靶點的分子機制，為其治療代謝性疾病藥物開發奠定基礎。

1 材料

1.1 藥品和試劑 胡椒堿（piperine，PIP）購于中國食品藥品檢定研究院。胰島素、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、二甲基亞砜（DMSO）、油紅O（oil red O）購于美國Sigma公司；羅格列酮購于成都恒瑞生物制藥公司；AICAR購于碧云天生物技術研究所；DMEM高糖培養基、PBS溶液、南美胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液購于美國Hyclone公司；胰蛋白酶消化液購于美國Gibco公司；葡萄糖測定試劑盒購于中生北控生物科技股份有限公司；Mouse Leptin（LEP） ELISA Kit，Mouse Adiponectin（ADP） ELISA Kit購于武漢華美生物工程有限公司；Trizol、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于北京康為公司；熒光定量引物由上海捷瑞公司合成；PVDF膜購于Millipore公司，ECL顯色試劑盒、Tris Base、30%丙烯酰胺、過硫酸銨（AP）、TEMED購于Bio-Rad公司；Tween-20、甘氨酸（glycine）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、PMSF、2-巰基乙醇、溴酚蘭購于北京鼎國生物技術有限責任公司；HCI購于天津市風船化學試劑有限公司；AMPKα，р-AMPKα抗體購于cellsignaling公司；AdipoR1，AdipoR2抗體購于SANTA公司；LepR，β-actin抗體購于proteintech公司。

1.2 細胞 HepG2細胞由中國科學院昆明動物研究所饋贈，用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養液培養，置于5%CO₂，37 ℃的濕潤培養箱中。

1.3 儀器 SW-CJ-1F型CO₂培養箱（日本三洋科技有限公司）；allegraX-22臺式離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；ABI Prism 7300熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；垂直電泳槽、電泳儀凝膠成像系統（Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 HepG2細胞IR模型的建立、分組和給藥 取對數生長期的HepG2細胞以3×104個/mL接種至96孔板。待細胞長至80%左右，用無血清的培養液饑餓處理24 h，使細胞同步化。設為正常組（N）、模型組（M）、陽性藥組（ROG，AICAR）、PIP組（2.5，5，10，20，40 μmol·L^-1）、溶媒組（0.1%DMSO）、陰性對照組（Compound C）以及Compound C+PIP組，每組設3個復孔，除正常外，其他各組用含10%脂肪乳的培養液分別誘導48 h，構建IR模型，成功制備IR模型后給藥24 h后，用葡萄糖氧化酶法（GOD-POD法）測定各實驗組和原DMEM培養基的葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量，葡萄糖消耗量為DMEM 培養基葡萄糖量與實驗組培養基葡萄糖量之差。并收集細胞，-80 ℃存儲備用。

2.2 酶聯免疫吸附測定（ELISA） 試驗按同樣的實驗方法建立IR模型、分組、給藥，分別收集PIP作用12，24，36，48 h的上清液，用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測脂聯素（APN）、瘦素（LEP）的含量。

2.3 實時熒光定量PCR 用Trizol提取細胞樣品的RNA，取1 μL測定樣品的濃度，以20 μL體系將1 μg RNA反轉錄成cDNA，并以此為模板，分兩步進行PCR擴增，第一步：95 ℃ 10 min，第二步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40 個循環。擴增所用熒光定量引物： Adiponectin上游引物序列5′-AGAATCATTATGACGGCAGCA-3′，下游引物序列5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3′，產物長度198 bp；Leptin上游引物序列5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3′，下游引物序列5′-TGTCTTATGTTCAAGCAGTGCCTAT-3′，產物長度138 bp；β-actin上游引物序列5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAAG-3′，下游引物序列5′-CCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3′，產物長度180 bp，由上海捷瑞公司合成。通過觀察溶解曲線和擴增曲線衡量結果，并以β-actin為內參，用2-ΔΔCt方法來對結果進行分析。

2.4 蛋白免疫印跡 用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液于冰上裂解細胞，離心后取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。將樣品用10%SDS-PAGE分離，電轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用以下一抗：AMPKα抗體（1∶1 000）、P-AMPKα抗體（1∶1 000）、AdipoR1抗體（1∶

1 000）、AdipoR2抗體（1∶500）、LepR抗體（1∶500）、β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗室溫孵育2 h，充分洗膜后用ECL發光液覆蓋膜，成像，分析。

2.5 統計分析 實驗數據采用±s表示。符合正態分布，方差齊性檢驗，比較均值的差異采用t檢驗，方差不齊，則用校正t檢驗，以P<0.05為差異有顯著水平。

3 結果

3.1 PIP對IR細胞模型糖代謝紊亂的改善作用 與模型組比較，陽性藥羅格列酮和AICAR及PIP各個給藥組能增加葡萄糖消耗量，AICAR抑制劑Compound C作用30 min，再加PIP作用也能增加葡萄糖消耗量（P<0.05），但作用均弱于PIP組（表1）。提示PIP有改善胰島素抵抗細胞糖代謝紊亂的作用，此作用很可能是依賴于AMPK信號通路。

3.2 PIP對HepG2細胞IR模型APN，LEP mRNA的影響 PCR檢測結果顯示，與模型組相比較，ROG，AICAR和各濃度的PIP能升高APN mRNA表達； Compound C+PIP能夠升高其表達水平，表明PIP可以對抗Compound C對APN mRNA的抑制作用，通過上調APN的 mRNA表達，激活AMPK信號通路，改善HepG2細胞IR模型的糖代謝紊亂。LEP mRNA與APN mRNA的表達趨勢相反，模型組的mRNA表達高于正常組；ROG，AICAR和各濃度的PIP（2.5 μmol·L^-1除外）均能降低LEP mRNA表達；Compound C與模型組比較，也顯著降低LEP mRNA表達，但作用弱于10 μmol·L^-1 PIP組和Compound C+PIP組（圖1）。

3.3 PIP對HepG2細胞IR模型p-AMPKα，AMPKα，AdipoR1，AdipoR2，LepR蛋白表達的影響 與模型組比較，ROG，AICAR的蛋白表達量升高（P<0.001），各濃度PIP組也能顯著升高p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表達，Compound C+PIP增加了p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表達，但作用弱于10 μmol·L^-1PIP組。而AdipoR1蛋白在各組之間沒有明顯變化。說明PIP通過上調AdipoR2的蛋白表達，激活AMPK信號通路，改善HepG2細胞IR模型的糖代謝紊亂。LepR蛋白表達與p-AMPKα/AMPKα，AdipoR2的蛋白表達趨勢相反。模型組LepR蛋白表達明顯升高，ROG，AICAR以及各濃度的PIP均能降低其蛋白表達；Compound C也顯著降低LepR的蛋白表達；但若將Compound C與Compound C+PIP與10 μmol·L^-1PIP相比，則Compound C顯著升高LepR的蛋白表達，Compound C+PIP又能降低其表達（圖2）。

4 討論

胰島素抵抗（IR）是2型糖尿病及其并發的肥胖、冠心病、高脂血癥、高血壓、腦卒中等疾病共同的病理生理基礎。這些并發癥是2型糖尿病患者致死、致殘的最主要原因^[8]。胰島素抵抗是機體對生理濃度的胰島素的敏感反應性低于正常生物學效應的一種病理狀態，主要表現為胰島素抑制肝臟葡萄糖釋放以及外周組織（脂肪和肌肉）利用葡萄糖能力下降^[9]。因此，以改善胰島素抵抗為靶點，從天然產物中開發治療2型糖尿病新型候選藥物具有重要價值。

蓽茇為胡椒科植物蓽茇Piper longum L.的干燥近成熟或成熟果穗，為中醫、藏醫、蒙醫和傣醫的常用藥物。蓽茇辛、熱，入胃、大腸經，功效為溫中散寒。故對脾氣虧虛胃寒引起的脘腹疼痛、嘔吐、腹瀉等癥有效。《中國藏藥》記載蓽茇味辛、苦，性溫。化味甘，具有“滋補體力，分離惡血和良血”功效。本研究前期實驗研究已證明，不同濃度的蓽茇醇提物及有效成分胡椒堿可顯著降低IR模型大鼠的FBS水平、血清FFA、血壓升高和改善糖耐量異常現象、增強胰島素敏感指數等關鍵指標的病理性變化、改善IR模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α和瘦素水平異常升高^[4-8]。然而其干預作用靶點尚未明確，需進一步研究。磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種在細胞內行使能量代謝調節的蛋白激酶，參與包括糖、脂肪、蛋白質以及細胞生長和凋亡等多種代謝過程。最近的研究發現， AMPK信號通路參與調節包括胰島β細胞、肝臟、骨骼肌和脂肪在內的多種外周組織的糖脂代謝過程。因此，AMPK已經成為以胰島素抵抗為主要病理生理基礎的糖尿病及肥胖癥等人類代謝性疾病及心血管疾病重要的治療新靶點 [10]。在以AMPK為核心的調節糖代謝信號通路中，上游主要有細胞因子脂聯素和抵抗素等。下游有葡萄糖轉運蛋白（GLUT） 4和糖原合成酶等^[10]。

HepG2 細胞是一種與人的正常肝細胞表型極為相似的肝胚胎瘤細胞株，胰島素水平越高，細胞表面胰島素受體的數目下降越多^[11]，因此，HepG2細胞可作為在細胞水平篩選改善胰島素敏感性的活性化合物的理想IR細胞模型。

APN是一種由脂肪細胞分泌的，具有多種生物學效應的細胞因子，通過特異性AdipoR介導，激活AMPK，PPARα，p38MAPK信號轉導通路，發揮調節血糖和脂肪代謝、增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化作用^[12-14]。AdipoR分為脂聯素受體1（AdipoR1）和脂聯素受體2（AdipoR2），AdipoR1在許多組織中都有表達，尤其在骨骼肌中；而AdipoR2主要在肝臟中表達^[15-17]。本結果表明，PIP能通過上調IR 模型APN水平蛋白表達，增加APN和AdipoR的結合率，從而激活AMPK信號通路，發揮改善IR狀態的糖代謝紊亂作用的。這與文獻報道的結果一致^[18-19]：脂聯素與其受體結合后，激活AMPK信號通路，進而能促進葡萄糖攝取。

LEP主要是由脂肪細胞分泌的細胞因子，主要通過與其受體（LepR）結合，控制食物攝入、維持能量平衡，并在免疫系統、內分泌系統、生殖發育、糖脂代謝和胰島素敏感性等方面發揮著重要的生理調節功能^[20-21]。LEP對IR具有雙向調節作用，在一定濃度范圍內抑制食欲，促進糖脂代謝；而當出現LEP抵抗時，LEP水平升高將降低胰島素的生物學效應，誘發IR，進而導致T2DM [22-23]。本實驗結果顯示：IR模型上清液中LEP含量、細胞中LEP mRNA和LepR蛋白表達較正常組均升高；PIP干預后，上清液中LEP含量、細胞中LEP mRNA和LepR蛋白的表達明顯下降，說明LEP與IR是正相關，與胰島素敏感性呈負相關^[24]。Compound C+PIP組也明顯降低了LEP mRNA表達和LepR的蛋白表達，只是效果弱于10 μmol·L^-1 PIP，提示PIP是可能通過AMPK信號通路調控LEP的表達，從而改善胰島素抵抗。要明確其作用機制，還需進一步深入研究。

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[責任編輯 張寧寧]