基于系統藥理學方法研究頭痛寧膠囊治療偏頭痛的TNF機制

聶西周+杜霞+張瑞瑞+何娟+蘇瑞+馬虎強+穆珺+李曄+劉峰

[摘要]頭痛寧膠囊是一種臨床上治療偏頭痛的中藥制劑，療效確切。該研究采用系統藥理學方法對頭痛寧膠囊治療偏頭痛的藥效成分及TNF機制進行了系統的研究。首先，從數據庫中收集頭痛寧膠囊單味藥材所含化學成分，首次采用ADME性質預測初篩頭痛寧膠囊的活性成分，然后利用CSDT模型進行靶標的搜尋和識別，并通過TTD等常見數據庫將靶點映射在偏頭痛疾病上來確定作用靶標。通過DAVID在線分析工具對靶標進行KEGG通路分析獲得與TNF機制相關的靶標。最后，采用Cytoscape軟件構建“藥材-成分-靶標”之間的網絡關系圖，通過度值和介數中心度的分析，確定TNF通路中的關鍵藥效成分及靶標，并對該作用機制進行初步探討。結果表明，頭痛寧膠囊中19個化合物與8個靶標在治療偏頭痛的TNF通路中起著至關重要的作用。該研究為頭痛寧膠囊藥效物質基礎及作用機制研究提供了一種新的研究策略，為該制劑藥效標志物的確定及臨床研究提供了必要的理論依據。

[關鍵詞]偏頭痛； 頭痛寧膠囊； 系統藥理學； 腫瘤壞死因子信號通路

[Abstract]Toutongning capsule （TTNC） is a traditional Chinese medicine（TCM） with good effect for treating migraine in clinical application. In this paper， a systems pharmacology method was carried out to study the TNF mechanism of the TTNC on the migraine. First， the ingredients for TTNC were collected from TCM databases， and ADME properties prediction was firstly applied to screen out the active compounds of TTNC. Then， the target searching and identification was performed by using CSDT model， and the targets were mapped to the migraine disease to determine the active targets through some common databases like TTD. To obtain the targets related with TNF signaling pathway， KEGG pathway analysis was performed by DAVID online analysis tool. Finally， the "herbs-compounds-targets" network was built by Cytoscape software. According to the results of degree and betweenness in the network， the key active compounds and targets were determined to explore the TNF mechanism for TTNC. Results showed that 19 active compounds and 8 targets played a crucial role in the treatment of migraine by TNF pathway for TTNC. This work provided a new perspective to deepen the understanding of the TNF signaling pathway mechanism in migraine treatment by TTNC， and may provide a necessary theoretical basis for the determination of effective markers and the clinical research of this medicine.

[Key words]migraine； Toutongning capsule； systems pharmacology； TNF signaling pathway

偏頭痛（migraine）是一種常見的慢性和陣發性神經系統疾病，有單側或雙側、搏動性發生的特點，常伴有惡心、嘔吐、畏聲、畏光等癥狀。流行病學調查結果顯示，全球每年有2.4億人發作偏頭痛，造成的年直接經濟費用高達580億，是困擾人類健康的常見疾病之一^[1]。近年來，雖然國內外已有很多針對偏頭痛的診斷指南并對其防治起到了一定的作用，諸如普奈洛爾和美托洛爾等化藥被認為是臨床上的一線用藥。但事實上偏頭痛的預防用藥情況并不如預想的那么樂觀，其服藥周期長常常會帶來諸多不良反應，諸如嗜睡、疲倦乏力、焦慮抑郁、肌肉酸痛、溢乳等副作用，都影響或限制了其應用。

中醫學對偏頭痛的認識早在《內經》中就有記載，有“首風”、“腦風”之稱。現代醫學認為，偏頭痛的發病機制有神經學說和血管源學說，同時，TNF通路也備受關注，偏頭痛患者TNF明顯偏高，認為是其發病及其治療的一條重要通路^[2]。研究表明，中藥防治偏頭痛不良反應相對較少，有較好的應用前景^[3-4]。頭痛寧膠囊是由陜西步長制藥研發生產的中藥復方制劑，由土茯苓、天麻、制何首烏、當歸、防風、全蝎6味藥材加工而成，具有熄風滌痰、逐瘀止痛之功效，臨床主要用于偏頭痛的治療，且療效顯著，未出現明顯的不良反應和藥物依賴性^[5-7]。目前，大多的研究集中在通過臨床療效探討其治療偏頭痛的作用機制，對其藥效物質基礎和分子作用機制的研究尚不明確。因此，從分子水平識別藥效成分和作用靶點，對于闡述整個復方的作用機制具有重要的意義。

系統藥理學是從分子、細胞到組織、器官等不同水平上建立藥物對于機體的作用，從微觀到宏觀的各個水平間相互關聯的新方法^[8]。該方法的出現為中藥復方的研究帶來了新的研究思路。目前，該方法已經成功運用于中醫藥基礎理論“君臣佐使”和“相須”的解析、對中藥及其復方的作用機制的研究、經方驗方的優化及新藥研發等方面^[9]。本研究基于系統藥理學方法，利用ADME性質篩選、靶標的識別、KEGG通路分析及網絡的構建和拓撲性質分析等手段，對頭痛寧膠囊治療偏頭痛的藥效成分及作用機制進行系統地探究，為臨床研究提供必要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 頭痛寧膠囊中藥材成分收集 頭痛寧膠囊是由土茯苓、天麻、制何首烏、當歸、防風和全蝎6味中藥組成的復方制劑。依托西北農林科技大學生命科學院創建的中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中國科學院上海有機化學研究所建立的化學專業數據庫、中國臺灣中醫藥大學建立的TCM Database@Taiwan數據庫及美國國家醫學圖書館提供的PubMed數據庫及文獻挖掘，對頭痛寧膠囊中藥材的化學成分進行了匯總，并建立頭痛寧膠囊化學成分數據庫。

1.2 ADME篩選 近年來，隨著計算化學和統計力學的快速發展，根據實驗中獲得的大量ADME數據建立合理的計算機預測模型，用于高通量的虛擬篩選，從而對化合物進行“早期評價、早期淘汰”已經成為新藥研發的重要策略之一。本研究將ADME性質預測引入到對頭痛寧膠囊藥效成分的初篩中，采用王永華等^[10]建立的Obioavail 1.1，preCaco2和基于最小二乘判別法的BBB預測模型對所有成分的OB（口服利用度），Caco-2，BBB（血腦屏障透過性）進行計算并初篩藥效成分，閾值設定采用文獻報道的OB≥30%，Caco-2≥-0.40和BBB≥-0.30^[8-9]。

1.3 靶標識別 本研究采用了一種基于隨機森林（random forests，RF）和支持向量機（support vector machine，SVM）算法的CSDT（cross-species drug-target）模型進行靶點的搜尋和識別工作。該模型的訓練集包括Drugbank數據庫中6 511個藥物分子和近4 000個與已知藥物分子作用的蛋白質，且結果顯示該模型的預測性能和諧性達到82.83%，敏感性為81.33%，特異性為93.62%，模型可靠。然后，借鑒UniProt（Universal Protein，UniProt）在線資源獲得所有靶點對應的基因信息。通過查找TTD數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）、CTD數據庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）和PharmGKB（Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGKB）將靶點映射于相應的疾病上，即可進一步獲得頭痛寧膠囊治療偏頭痛疾病的藥效成分及其對應的靶標和基因信息。

1.4 KEGG信號通路分析 DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）是一種可以直觀觀測到基因的富集通路、目標基因對應的蛋白及其相互關系的在線分析工具。本研究采用DAVID對頭痛寧膠囊作用靶標進行KEGG分析，從而確定TNF通路相關的藥效化合物及靶標，以便進行網絡的構建和分析。

1.5 網絡的構建和分析 采用Cytoscape 3.4軟件構建藥材-成分-靶標的相互作用網絡，其中，藥材、成分和靶標用節點（node）表示，節點之間的相互作用用邊（edge）表示。然后，利用Cytoscape軟件中的NetworkAalyzer插件分析網絡拓撲性質：度（degree）和介數中心度（betweenness），度和介數中心度越高，該化合物或靶標在網絡中越重要，是網絡的關鍵樞紐，在治療疾病中發揮著關鍵的作用。

2 結果和討論

2.1 頭痛寧膠囊化學成分數據庫 頭痛寧膠囊全方中含動物藥全蝎，現代藥理學研究表明^[11]，全蝎主要活性成分為蝎毒素，是一種活性多肽，由20～70個氨基酸組成，具有鎮痛的藥理活性，有關蝎毒素鎮痛機制的研究已有報道^[12]。然而，對于方中5味植物藥，未見具體成分的機制報道。本研究采用數據庫及文獻搜集確定了5種植物藥中所含的410種化學成分。其中，當歸含125種，土茯苓含74種，防風含173種，天麻含16種，制何首烏含22種。這些化合物中，胡蘿卜苷、β-谷甾醇和棕櫚酸等5種化合物既存在于當歸，也存在于土茯苓，白藜蘆醇和棕櫚酸等5種成分共同存在于土茯苓和制何首烏，當歸和防風的共有易揮發性成分5種。這些化學成分多為黃酮、有機酸和酯類，據文獻報道^[13-15]，黃酮類成分確有鎮痛、調節心血管系統和抗炎調節免疫的藥理作用，有機酸和酯類成分在抗血小板凝集、抗炎、止痛、抗氧化等方面的藥理活性也已經得到證實。

2.2 ADME篩選 采用王永華等^[10]建立的ADME篩選模型獲得上述410種化合物的OB，Caco-2和BBB值，通過篩選獲得159個ADME性質較好的化合物用于后續研究。這些化合物大多為酚酸酯類和黃酮類化合物，例如：藁本內酯（MOL002201，OB=51.30%，Caco-2=1.30，BBB=1.24）、香草醛（MOL000635，OB=52.00%，Caco-2=0.68，BBB=0.41）、香草酸（MOL000114，OB=35.47%，Caco-2=0.43，BBB=0.09）、川白芷內酯（MOL011732，OB=59.65%，Caco-2=0.56，BBB=-0.02）、紫花前胡素（MOL013077，OB=39.27%，Caco-2=0.77，BBB=0.25）、人參炔醇（MOL001949，OB=42.44%，Caco-2=1.52，BBB=1.03）和珊瑚菜素（MOL011749，OB=43.39%，Caco-2=0.90，BBB=0.43）；黃酮類成分如：漢黃芩素（MOL000173，OB=30.68%，Caco-2=0.79，BBB=0.04）。這些化合物中部分化合物已被證明在治療中樞神經系統性疾病有較好的藥理學活性。例如：當歸中的藁本內酯具有鎮痛、抗炎、舒張血管的藥理作用^[16-17]，防風中的人參炔醇既對缺血性損傷細胞具有保護作用，也對神經具有營養和保護作用^[18]。除此之外，白藜蘆醇（MOL012744，OB=19.07%，Caco-2=0.80，BBB=-0.01）、云杉新苷（MOL000105，OB=21.44%，Caco-2=-0.90，BBB=-1.81）、落新婦苷（MOL004575，OB=36.46%，Caco-2=-1.29，BBB=-1.85）、新落新婦苷（MOL013118，OB=40.54%，Caco-2=-1.07，BBB=-1.57）、花旗松素（MOL004576，OB=57.84%，Caco-2=-0.23，BBB=-0.80）和天麻素（MOL007986，OB=8.19%，Caco-2=-1.33，BBB=-2.29）的ADME性質較低，但這些化合物已被證明在鎮痛、心血管神經系統具有較好的藥理活性。天麻素具有明顯的鎮痛、鎮靜、抗衰老等藥理活性^[19]，落新婦苷、新落新婦苷在心血管神經系統的藥理作用明顯^[20]，而云杉新苷、花旗松素和白藜蘆醇在中樞神經系統的鎮痛抗炎作用也具有較為明顯藥理學特征^[20-22]。因此，最終確定165個化合物作為潛在的藥效成分用于后續的研究。

2.3 靶標的識別 采用CSDT模型進行靶標的識別，并將所有靶點映射到疾病基因數據庫中，對潛在藥效成分和靶點、基因進行二次篩選，最終獲得120個化合物和與之對應的482個靶標（去重后得45個靶點）。

2.4 KEGG信號通路分析 圖1為頭痛寧膠囊的所有靶標的KEGG通路分析結果。從圖中可以看出，頭痛寧膠囊治療偏頭痛的通路主要有鈣信號、NF-κB，cAMP以及TNF等16種通路，其中，與TNF通路相關聯的靶標有8個，與之對應的藥效化合物高達106個，且與5種藥材均有關聯，是所有通路中與疾病相關的藥效成分及靶標數最多的通路之一，因此，該通路可能為頭痛寧膠囊治療偏頭痛的重要通路之一。

2.5 網絡構建及TNF通路分析 圖2為與TNF通路相關的藥材、藥材的藥效成分和與之對應的8個靶標相連構建H-C-T網絡關系圖。網絡中包含103個節點（含5個藥材、106個化合物和8個靶標）和252條邊。圖中，綠色圓形節點代表藥材，紫色三角形節點代表藥效化合物，藍色圓角矩形節點代表藥物靶標，每條邊代表不同節點之間的相互作用關系。采用網絡分析獲得網絡關系的拓撲性質——度（degree）和介數中心度（betweenness），根據度值和介數中心度值判斷頭痛寧膠囊通過TNF通路治療偏頭痛的關鍵成分和靶標。最終，獲得19個在TNF通路中起重要作用的化合物和8個靶標，見表1，2。其中，白藜蘆醇（resveratrol，degree=16，betweenness=0.083 5）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，degree=12，betweenness=0.004 9）、香草醛（vanillin，degree=10，betweenness=0.014 7）和漢黃芩素（wogonin，degree=10，betweenness=0.034 5）表現出較高的度和介數中心度值，這些成分在治療偏頭痛的TNF通路中至關重要。例如：白藜蘆醇可顯著抑制TNFR1的表達，進而抑制TNF-α刺激引起的炎癥因子的釋放，減輕內皮炎癥^[23]，而漢黃芩素具有調節機體免疫作用的活性，能夠抑制 NF-κB轉錄因子對TRAIL 誘導的凋亡的作用^[24]。

偏頭痛是一種神經血管疾病，TNF通路是偏頭痛發病機制的重要通路，圖3為TNF作用通路圖，圖中紅色代表與頭痛寧膠囊相關的8個靶標。這8個靶標中前列腺素G/H合成酶2（PTGS2，degree=101，betweenness=0.793 5）表現出特別高的度和介數中心度值，是TNF通路中的關鍵靶標，PTGS2基因是前列腺素的生物合成的核心酶，腦血管收縮是偏頭痛前驅期的特征，而頭痛發作時腦血管擴張呈特征性變化，PTGS2則是被認為的偏頭痛的致痛因子之一^[25]。另據黃銀蘭等^[26]報道利用本經取穴可調控PTGS2基因表達從而治療偏頭痛，這也說明PTGS2與偏頭痛有著密切的聯系，但是目前尚無文獻報道PTGS2治療偏頭痛的作用機制。此外，轉錄因子p65（RELA，degree=6，betweenness=0.021 3）、轉錄因子AP-1（JUN，degree=8，betweenness=0.004 3）和腫瘤壞死因子（TNF，degree=4，betweenness=0.007 1）也是該通路的主要靶標，與偏頭痛的作用機制密切相關。ICAM1，IL6這2種基因在偏頭痛的病變過程中可起到的誘導作用^[27]，兩者存在相互關系并參與偏頭痛機制的發生，而NF-κB在偏頭痛的發病機制中，可增加FOS表達的作用，從而參與偏頭痛的發生^[28]。MMP9則是參與炎癥反應病理生理過程的一種重要物質，有研究表明^[29]，MMP9可參與了偏頭痛的病理生理過程。TNF因子在調節免疫功能的同時，過量可造成對組織的損傷^[30]，參與偏頭痛的發生。因此，頭痛寧膠囊呈現出的多分子、多靶點協同作用優勢明顯，主要活性成分可參與TNF通路的調節作用，對偏頭痛發病機制各環節的調節，從而達到治療偏頭痛的目的。

此外，從結果中還可以看出，同一種藥物成分往往作用于多個靶標，每個靶標至少與2個以上的化合物相聯系，例如：白藜蘆醇為制何首烏藥效成分，與8個靶標均有作用，β-谷甾醇是防風所含化合物，作用于PTGS2，IL6，JUN，RELA和TNF這5個靶標，當歸中的香蘭素和漢黃芩素分別作用于2個（PTGS2和JUN）和3個靶標（PTGS2，JUN和MMP9），這些結果也體現了中藥復方多成分、多靶標的作用特點。

3 結論

本研究采用系統藥理學方法對頭痛寧膠囊治療偏頭痛的TNF通路進行研究，通過ADME預測、靶標識別、網絡構建與分析，從“藥物-靶點-疾病”關聯性對頭痛寧膠囊治療偏頭痛的相關作用機制進行分析，能夠作用于偏頭痛相關的TNF通路中8個靶標為關鍵作用靶標，19個化合物為潛在關鍵活性成分，為頭痛寧膠囊藥效物質基礎及作用機制研究提供了一種新的研究策略，為該制劑藥效標志物的確定及臨床研究提供了必要的理論依據。

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[責任編輯 張寧寧]