退火溫度、DNA聚合酶和擴增儀對水稻品種真實性SSR分子檢測質量的影響

于曉岳+楊華+鄒芳剛

摘要：SSR標記法已經被廣泛應用到水稻品種真實性的鑒定中，此方法具有快速、穩定等特點。本研究對比了不同退火溫度、DNA聚合酶以及PCR擴增儀等因素對水稻品種真實性SSR分子檢測方法的影響，旨在探討如何根據實驗室自身情況選擇適合的反應體系和反應條件來順利地開展檢測工作。結果表明，55 ℃退火溫度的PCR產物較有利于水稻品種真實性SSR標記的檢測；2種PCR儀性能比較一致，均適合水稻品種真實性SSR標記的檢測；TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均適合水稻品種真實性SSR標記的檢測，天根Taq DNA聚合酶不適合水稻品種真實性SSR標記的檢測。不同實驗室，應選擇以上3個適合實驗條件進行組合，以提高水稻品種真實性和純度分子檢測的準確性。

關鍵詞：水稻；SSR；品種真實性檢測；退火溫度；PCR擴增儀；DNA聚合酶

中圖分類號： S511.01 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0057-03

SSR稱為簡單重復序列（simple sequence repeat），也可以稱為微衛星DNA（microsatellite DNA）。SSR是由1～6個核苷酸為重復序列組成的串聯重復序列，這些簡單重復序列隨機、均勻，并且廣泛存在于真核生物的基因組上[1] 。分子標記（molecular markers）是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接反映。以這種簡單重復序列為基礎的標記技術被稱為分子標記技術，SSR分子標記由Moore等于1991年創立[2]。由于SSR分子標記具有非組織和發育階段特異性、不易受外界環境影響、多態性高、在基因組中分布廣泛、呈共顯性遺傳等優點，目前已經被廣泛應用在農作物品種的真實性鑒定和純度鑒定中[3-6]。2014年我國農業部修訂了2007年版本的水稻品種鑒定標準，發布了行業推薦標準 NY/T 1433—2014 《水稻品種鑒定技術規程：SSR標記法》，因分子標記檢測具有快速、穩定等特點，該技術規程在全國廣泛應用；但是分子檢測結果的可靠性和準確性，與實驗條件和實驗操作人員的實驗技能有一定的關系，為提高江蘇水稻品種真實性和純度鑒定結果的準確性，本研究對江蘇省種子管理站種子質量檢驗室現有的實驗條件進行了組合比較，擬篩選較適合江蘇水稻品種真實性和純度鑒定的實驗條件，在江蘇范圍內推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料

以水稻品種淮稻5號和連粳7號為試驗材料。

1.2 引物

選取NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規程：SSR標記法》（2014年6月1日實施）中12對SSR引物，引物名稱及序列詳見表1，引物由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.3 試劑

（1）DNA提取：選用OMEGA公司生產的植物基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A. TM Plant DNA Kit D3485-01）提取2個品種的DNA。

（2）Taq DNA聚合酶：選用TaKaRa公司、天根生物科技（北京）有限公司及生工生物工程（上海）股份有限公司的Taq DNA聚合酶。

1.4 主要儀器

使用賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）的NanoDrop 2000超微量分光光度計，檢測提取的DNA模板的濃度和質量；分別用BIO-RAD公司生產的 My cycler和 Agilent Technologies公司生產的Sure Cycler 8800擴增儀進行PCR擴增；采用美國Bio-rad伯樂 GelDoc XR System凝膠成像系統對銀染后的聚丙烯酰胺凝膠拍照。

1.5 DNA 模板準備

用試劑盒提取完DNA后，用超微量分光光度計檢測2個品種的DNA模板濃度，將其分別稀釋到相同濃度使用。

1.6 實驗條件設計

本實驗采用50 ℃、55 ℃及60 ℃ 3個退火溫度和3種不同來源的Taq DNA聚合酶在2種PCR擴增儀上對2個品種的DNA模板PCR擴增，為便于標記圖片和分析結果，分別對實驗條件進行編號（表2），并按照表3的實驗條件組合進行。

2 結果與分析

2.1 DNA模板質量檢測與稀釋

用DNA提取試劑盒提取的DNA模板，微量分光光度計檢測后結果見表4。D280 nm是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長，D260 nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，D230 nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長。純DNA的D260 nm/D280 nm比值為1.8，純DNA和 RNA的D260 nm/D230 nm比值為2.5。檢測結果表明，所提取DNA 模版質量較高，蛋白質、RNA、多糖和酚類等雜質基本去除，能夠滿足進行SSR分子標記分析的質量要求（表4）。根據每個樣品的原始DNA濃度，稀釋至50 ng/μL 備用。

2.2 退火溫度對品種真實性SSR標記擴增產物質量的影響

18個實驗條件組合中有6組組合可比較3種不同溫度下品種真實性SSR標記PCR產物的質量。分別為ⅠaA、ⅡaA、ⅢaA，ⅠaB、ⅡaB、ⅢaB，ⅠbA、ⅡbA、ⅢbA，ⅠbB、ⅡbB、ⅢbB，ⅠcA、ⅡcA、ⅢcA，ⅠcB、ⅡcB、ⅢcB。以ⅠaA、ⅡaA、ⅢaA，ⅠaB、ⅡaB、ⅢaB等2組組合電泳圖譜（圖1）為例，對PCR產物電泳譜帶的清晰度比較可知，50 ℃退火溫度非特異性產物較多，電泳譜帶彌散背景較多；55 ℃退火溫度，擴增特異性目標條帶清晰，電泳譜帶背景干凈，便于后續的比較分析；60 ℃退火溫度擴增特異性目標條帶不及55 ℃退火溫度擴增特異性目標條帶清晰，且其他5組組合中也是如此，因此，以55 ℃退火溫度的PCR產物較有利于水稻品種真實性SSR標記的檢測。

2.2 不同擴增儀對品種真實性SSR標記PCR產物質量的影響

18個實驗條件組合中有9組組合可比較2種不同品牌擴增儀的PCR產物的質量，分別為ⅠaA、ⅠaB，ⅠbA、ⅠbB，ⅠcA、ⅠcB，ⅡaA、ⅡaB，ⅡbA、ⅡbB，ⅡcA、ⅡcB，ⅢaA、ⅢaB，ⅢbA、ⅢbB，ⅢcA、ⅢcB。以其中2組組合ⅢbA、ⅢbB和ⅢcA、ⅢcB電泳圖譜（圖2）為例，結果表明無論是條帶特性高低與否、背景清晰與否，儀器對結果的影響并不明顯，其他幾個組合的結果亦如此，本實驗表明2種PCR儀性能比較一致，均適合水稻品種真實性SSR標記的檢測。

2.3 不同品牌的Taq DNA聚合酶對品種真實性SSR標記方法檢測結果的影響

18個實驗條件組合中有6組組合可比較3種不同品牌的聚合酶擴增后的結果，分別為ⅠaA、ⅠbA、ⅠcA，ⅡaA、ⅡbA、ⅡcA，ⅢaA、ⅢbA、ⅢcA，ⅠaB、ⅠbB、ⅠcB，ⅡaB、ⅡbB、ⅡcB，ⅢaB、ⅢbB、ⅢcB。以ⅠaA、ⅠbA、ⅠcA和ⅠaB、ⅠbB、ⅠcB電泳圖譜（圖3）為例，TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶的PCR產物電泳譜帶特異性高，目標條帶清楚、雜帶少、背景清晰，便于后期的成像分析；天根Taq DNA聚合酶的PCR產物電泳譜帶特異性尚可、目標條帶較清楚，但雜帶多、背景不清晰。其他幾個組合的結果亦如此，本實驗結果表明TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均適合水稻品種真實性SSR標記的檢測，天根Taq DNA聚合酶不適合水稻品種真實性SSR標記的檢測。

3 小結與討論

在利用分子標記法鑒定品種真實性的方法中，一個重要環節是PCR的擴增，只有擴增出特異性高、雜質少的擴增產物，才能在后續聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色后得到條帶清晰、背景干凈的指紋圖譜，方便后續的讀圖、分析和鑒定。而影響PCR反映的條件主要分為2個方面：一是PCR體系和反應環境。本研究中主要對這2種影響因素中的Taq DNA聚合酶、退火溫度以及不同公司的儀器進行了比較分析，結果表明，55 ℃ 退火溫度的PCR產物較有利于水稻品種真實性SSR標記的檢測；2種PCR儀性能比較一致，均適合水稻品種真實性SSR標記的檢測；TaKaRa及生工Taq DNA聚合酶均適合水稻品種真實性SSR標記的檢測。

綜上所述，如果準備開展SSR標記法對水稻品種真實性進行鑒定，應根據所在實驗室的具體情況對PCR的反應體系和反應環境等進行相應的預實驗和對比，根據實驗室的儀器設備和資金預算等多個方面，選擇適合的條件以滿足真實性室內分子檢測工作開展的需要，保證鑒定結果的準確性。當然，SSR標記法也有著一些局限性，隨著生物技術的飛速發展，新技術、新方法也將運用到品種真實性檢測中，例如毛細管電泳法、熒光標記法、SNP分子標記法、芯片技術乃至二代、三代測序技術等[7-8]。但無論哪種新型技術，由于分子方法的結果有不可預見性，在檢驗室開展和應用一項技術前，都應該根據實驗室的具體情況開展一系列的摸索和對比試驗，只有這樣才能保證實驗室檢測結果的穩定性、重演性、準確性，真正為農業主管部門、執法部門提供最快速、最有利的技術支撐，在種子市場凈化乃至整個種業發展中發揮巨大的作用。

參考文獻：

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