光質、光強和外植體對虎杖愈傷組織增殖及白藜蘆醇積累的影響

肖林霞+盧其能+李潤根

摘要：研究了光質、光強、外植體來源對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響。結果表明，綠光和黃光有利于虎杖愈傷組織增殖，藍光最適合于愈傷組織中白藜蘆醇的積累；長期培養條件下，弱光和中強光比強光更利于白藜蘆醇的積累；以莖段作為外植體，虎杖愈傷組織的增殖速度和白藜蘆醇含量都明顯高于葉片和葉柄。

關鍵詞：虎杖；愈傷組織；白藜蘆醇；光質；光強；外植體

中圖分類號： S567.23+9.043 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0060-04

白藜蘆醇（resveratrol）是一種具有多種生物活性的非黃酮類多酚化合物，是植物受到外界刺激而產生的一種植物抗毒素，主要存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，且在虎杖根莖中含量最高。白藜蘆醇不僅能提高植物的抗病性，還具有多種有益于人類健康的藥理作用，主要包括抗氧化、抗腫瘤、抗炎抗菌、抗衰老、預防心血管疾病、雌激素作用、保護肝臟等[1-2]。因此，白藜蘆醇不僅能用于醫藥和保健品市場，還能用于化妝品市場，需求量大。目前，白藜蘆醇的主要來源依然是從天然植物中提取，為了防止植物資源被過度采挖，已有較多的利用生物技術（如組織培養、生物轉化和轉基因等技術）來生產白藜蘆醇的研究。但光質、光強、外植體對虎杖愈傷組織生長及其白藜蘆醇含量的影響還鮮有報道。因此，本試驗研究了LED光質、光強、外植體來源對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇含量的影響，旨在獲得適合虎杖愈傷組織白藜蘆醇積累的光照條件和外植體來源，為將來利用組織培養技術大規模生產白藜蘆醇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

虎杖采自江西省吉安市新干縣。

1.2 方法

1.2.1 虎杖愈傷組織的誘導

取虎杖的幼嫩莖段，消毒后接至快繁培養基中，獲得無菌小苗后將其接至生根培養基中，獲得虎杖幼苗。按曹庸等誘導虎杖愈傷組織的方法[3]，略作改動進行愈傷組織誘導。將無菌幼苗的葉片剪成適當大小，葉柄和莖段切至適當長度，接至愈傷誘導培養基（MS+0.3 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D）中，黑暗條件下培養，溫度為（25±1） ℃。約20 d后即得到愈傷組織，并用該培養基進行繼代。

1.2.2 LED光質對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

將來源于葉片的5塊大小一致的虎杖愈傷組織接至上述愈傷組織誘導培養基中，置于綠、藍、紅、黃、白LED光照及黑暗下培養，光照強度為3 000 lx，溫度為（25±1） ℃，每處理重復15瓶。在培養6、12、18、24、30 d后，隨機取不同光質及黑暗條件下的愈傷組織3瓶，合并同一處理下的愈傷組織，稱其總質量，計算愈傷組織增殖倍數，提取并測定其白藜蘆醇含量，再根據愈傷組織質量，計算白藜蘆醇總量。本試驗重復3次。

1.2.3 光照強度對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

將來源于葉片的5塊大小一致的虎杖愈傷組織接至上述愈傷組織誘導培養基中，置于不同光強的藍色LED光質下培養，光照強度分別為1000、3 000、5 000 lx，溫度為（25±1） ℃，每處理重復15瓶。隨后的處理同光質組。

1.2.4 外植體來源對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

分別將來源于葉片、葉柄、莖段的5塊大小一致的虎杖愈傷組織接至上述培養基中，置于相同光照強度的藍色LED光質下培養，光照強度為3 000 lx，溫度為（25±1） ℃，每處理重復15瓶。隨后的處理同光質組。

1.2.5 虎杖愈傷組織白藜蘆醇的提取與測定

1.2.5.1 白藜蘆醇的提取

參考劉小麗等超聲提取虎杖中白藜蘆醇的方法[4]，稍作改動。精確稱取2 g虎杖愈傷組織，用研缽搗碎研磨成勻漿后轉移到100 mL的錐形瓶中，加入20 mL 85%的乙醇，超聲波50 ℃提取30 min后，減壓抽慮得到澄清的提取液，再用旋轉蒸發儀50 ℃濃縮至干，加入1 mL甲醇超聲溶解，并用0.45 μm的有機濾膜過濾即得供試品溶液，置于4 ℃保存備用。

1.2.5.2 白藜蘆醇的檢測

白藜蘆醇的含量使用安捷倫1200系列液相色譜系統測定。色譜柱為C18（150 mm×4.6 mm），流動相采用甲醇-重蒸水（35 ∶65）混合溶劑，流速為0.8 mL/min，檢測波長為306 nm，每次進樣10 μL，柱溫為30 ℃。

1.2.5.3 白藜蘆醇標準曲線的制定

精確稱取10 mg白藜蘆醇標準品，用甲醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為 100 μg/mL 的對照品溶液，分別吸取該溶液1、2、3、4、5、6、7 mL，并定容至50 mL，即得濃度分別為2、4、6、8、10、12、14 μg/mL 的對照品溶液。依次取10 μL進樣后，以測得的白藜蘆醇峰的峰面積（y）為縱坐標，以白藜蘆醇濃度（x）為橫坐標進行線性回歸，得到回歸方程為y=85.377x-83.386，r2=0.999 3。

供試品溶液按與對照品溶液相同的色譜條件進樣，獲得白藜蘆醇供試品溶液和對照品溶液的色譜圖（圖1、圖2），根據峰面積計算供試品溶液中白藜蘆醇的含量。

2 結果與分析

2.1 LED光質對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

2.1.1 LED光質對虎杖愈傷組織增殖的影響

LED光質對虎杖愈傷組織增殖有明顯影響。各條件下愈傷組織的增殖速率均是先變快后減慢，總體上增殖效果為綠光、黃光>藍光>紅光、白光>黑暗，綠光略大于黃光，紅光略大于白光（圖3）。由此可見，光照有利于愈傷組織的增殖，且單色光效果強于白光。

2.1.2 LED光質對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響

除在黑暗條件下虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的含量一直變化不大外，光照條件下白藜蘆醇的含量均是在培養6 d后最高，之后逐漸下降趨于穩定。但藍光下白藜蘆醇的含量一直明顯高于其他條件，光質條件下白藜蘆醇的含量總體上是藍光>黃光>白光>紅光>綠光>黑暗（圖4）。由此可見，光照有利于白藜蘆醇的積累，其中藍光有利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的合成，而綠光不利于白藜蘆醇的合成。

2.1.3 LED光質對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇總量的影響

不同光質條件下愈傷組織中白藜蘆醇的總量都是在培養24 d時達到最大，且藍光下白藜蘆醇的總量明顯高于其他光質條件，而紅光下白藜蘆醇的總量最低（圖5）。由此可見，藍光利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的積累， 而紅光不利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的積累。

2.2 光照強度對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

2.2.1 光照強度對虎杖愈傷組織增殖的影響

光照強度對虎杖愈傷組織增殖有影響，不同光照強度對虎杖愈傷組織增殖的效果依次為弱>中>強（圖6）。由此可見，弱光有利于虎杖愈傷組織的增殖，強光不利于虎杖愈傷組織的增殖。

2.2.2 光照強度對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響

光照強度對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量有影響，培養12 d以前強光下愈傷組織中白藜蘆醇的含量最高，而18 d以后中等強度條件下的白藜蘆醇含量最高（圖7）。由此可見，強光適合于短期處理，而中強光適合于長期培養用。

2.2.3 光照強度對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇總量的影響

弱光和中強光下白藜蘆醇的總量差別不大，在培養的前12 d強光下白藜蘆醇的總量略高，而18 d以后則明顯低于弱光和中強光（圖8）。由此可見，弱光和中強光適于長期培養下虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的積累。

2.3 外植體來源對虎杖愈傷組織增殖及其白藜蘆醇積累的影響

2.3.1 外植體來源對虎杖愈傷組織增殖的影響

外植體來源對虎杖愈傷組織增殖有影響，由莖段作為外植體誘導的愈傷組織增殖效果最好，而由葉片和葉柄作為外植體誘導的愈傷組織增殖效果相近，葉柄略優于葉片（圖9）。由此可見，以莖段作為外植體利于虎杖愈傷組織的增殖。

2.3.2 外植體來源對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響

外植體來源對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量有影響，以葉片、莖段、葉柄作為外植體來源的虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的含量依次為莖段>葉片>葉柄，且以莖段作外植體誘導的愈傷組織中白藜蘆醇含量明顯高于葉片和葉柄（圖10）。因而，以莖段作為外植體有利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的合成。

2.3.3 外植體來源對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇總量的影響

外植體來源對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇總量有影響，以莖段作為外植體的愈傷組織中白藜蘆醇的總量明顯高于葉片和葉柄（圖11）。由此可見，以莖段作為外植體利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的積累。

3 討論

在組織培養中，光是影響植物愈傷組織生長和內部生理生化反應進程的重要環境因子[5-6]。光對不同植物愈傷組織生長及其次生代謝產物的積累有不同的效應。外植體來源也是影響植物愈傷組織增殖和次生代謝產物積累的一個重要因素。本試驗結果表明，光質和光照強度對虎杖愈傷組織生長及其白藜蘆醇的積累有明顯影響。不同光質條件下虎杖愈傷組織的增殖效果為綠光、黃光>藍光>紅光、白光>黑暗，說明光照有利于虎杖愈傷組織的增殖，黃光和綠光有利于虎杖愈傷組織的生長。但綠光不利于白藜蘆醇的積累，而藍光下白藜蘆醇的積累量明顯高于其他光質，是最適于虎杖愈傷組織白藜蘆醇積累的光質條件。弱光有利于虎杖愈傷組織的增殖，強光短期處理能明顯提高白藜蘆醇的含量，但長期培養條件下，弱光和中強光比強光更利于白藜蘆醇的積累。以莖段作為外植體，無論是愈傷組織增殖速度還是白藜蘆醇的積累量都要明顯高于葉片和葉柄。羅麗媛等研究了LED不同光質對葡萄愈傷組織及白藜蘆醇合成的影響，發現綠光最有利于葡萄愈傷組織的生長，但抑制白藜蘆醇的合成；藍光對愈傷組織生長無明顯影響，但能明顯促進白藜蘆醇含量和產量的提高；紅光不利于自藜蘆醇的積累[7]，本試驗研究結果與其一致。周華等研究了不同波長LED光源對生菜生長和品質的影響，也發現藍光能提高生菜的維生素C 和粗蛋白質含量[8]。趙德修等對水母雪蓮愈傷組織的培養中也發現藍光能顯著提高黃酮的合成[9]。文濤等以虎杖莖段、葉片為外植體，研究了不同光照強度對虎杖愈傷組織的影響，也發現適當的光照強度能促進虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的合成；且以莖段作為外植體，虎杖愈傷組織的生物量和白藜蘆醇含量也是明顯高于葉片作為外植體[10]。尹明華也發現藍光有利于江西鉛山紅芽芋試管苗可溶性總糖含量和可溶性蛋白質含量的增加[11]。但也有一些研究者在對不同植物組織培養的試驗中，得出了不同的結論，如張真等認為黃光最有利于葡萄愈傷組織的增殖，而白光最有利于白藜蘆醇的積累[12]；劉浩等發現LED 紅光下愈傷組織的增殖倍數和蘿卜硫素含量均為最高[13]；申海進等研究了濾光膜處理對花期野菊光合特性和葉綠素熒光的影響，發現紅膜下類胡蘿卜素含量最高[14]；吳祝華等發現紅光下非洲菊產花狀況最好[15]。導致研究結果不一致的原因可能有：不同的植物生長、發育受光的調節作用不同；培養基的成分和光照的波長及輻照等不同也會影響光照對植物組織培養物生長和發育的效應[16]。由此可見，光形態建成的復雜性，需要進行更深入的研究。

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