斑節對蝦金屬硫蛋白全基因DNA克隆及生物學信息分析

周發林+鄭麗明+楊其彬+黃建華+楊麗詩+江世貴

摘要：為深入研究斑節對蝦（Penaeus monodon）金屬硫蛋白MT（Pm-MT）基因參與斑節對蝦性腺發育調控的分子機制，根據Pm-MT基因的cDNA序列，利用普通PCR和染色體步移（Genome Walking）技術獲得Pm-MT基因的DNA全長序列，該基因序列DNA全長為2 744 bp，由2個內含子和3個外顯子組成。其中啟動子區域為806 bp，2個內含子長度分別為1 194、242 bp，3個外顯子長度分別為22、78、77 bp。在啟動子區域預測到轉錄因子糖皮質激素應答元件和雌激素應答元件與卵巢發育密切相關。

關鍵詞：斑節對蝦（Penaeus monodon）；金屬硫蛋白；全基因DNA克隆；生物信息學分析

中圖分類號：S945.4+7；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0575-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.047

Cloning and Bioinformatic Analysis of Metallothionein Gene DNA

Sequence in Penaeus monodon

ZHOU Fa-lin， ZHENG Li-ming， YANG Qi-bin， HUANG Jian-hua， YANG Li-shi， JIANG Shi-gui

（South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Guangzhou 510300， China）

Abstract： For further research on the molecular mechanism of Penaeus monodon MT （Pm-MT） involved in Gonadal development regulation，the PCR and genome walking technology was used to obtain the full length of Pm-MT DNA sequence，basis of the cDNA sequence. The full length of Pm-MT DNA sequence was 2 744 bp，made up of 2 introns and 3 exons. The promoter region was 806 bp，the length of introns were 1 194 bp and 242 bp respectively，the exons were 22 bp，78 bp and 77 bp each. And that predicted in the promoter region of glucocorticoid receptor element and estrogen response element with the ovarian development of two closely related transcription factors.

Key words： Penaeus monodon； metallothionein； gene DNA sequence clone； bioinformatic analysis

金屬硫蛋白（Metallothioneins，MTs）是一類富含半胱氨酸的胞內小分子蛋白，在動物、植物和微生物的細胞內廣泛分布[1-3]。大量研究已證明，MTs具有調解氧自由基和氮氧化物并抑制細胞凋亡、重金屬解毒、降低紫外線/離子輻射以及參與應激反應等多種生物學功能[4-12]。此外，MTs在生殖方面的功能也有不少報道。劉代成等[13]研究發現，血清孕酮和肝MTs之間呈正相關。Ioachim等[14]發現，MT基因在正常子宮內膜中的表達水平與雌、孕激素受體（ER、PR）呈負相關。Espey等[15]研究表明，絨毛膜促性腺激素（HCG）能促進小鼠卵巢中MT mRNA的表達顯著增加。以上結果均表明，該基因參與了動物的生殖和繁育過程。

已有研究表明，斑節對蝦MT的mRNA在其6個不同發育期的卵巢中表達量均很高，其中在Ⅱ期卵巢中的表達量最高[16]。因此，MT基因可能在斑節對蝦卵巢發育過程中發揮了重要的調節作用。為了更深入研究這一功能，本研究克隆分析MT全基因DNA序列，為該基因在斑節對蝦卵巢發育中分子調控機理提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

斑節對蝦來源于海南省三亞市附近對蝦養殖池塘，其體重20～30 g，用于DNA克隆分析。試驗用蝦在水溫（25±1） ℃、鹽度為3%的循環水池中暫養3 d后使用。

1.2 化學試劑

BspQⅠ、NotⅠ購自NEB公司；T4連接酶、Ex Taq購自TaKaRa公司；DNA分子量標準λDNA/Hind Ⅲ購自東盛公司；PCR 產物清潔試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自AxyGen公司；基因組DNA純化試劑盒E.Z.N.A.？誖 MicroElute？誖 DNA Clean-Up Kit（D6296-00）購自OMEGA公司；海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（DP324-02）、二抗（羊抗鼠IgG-HRP）和增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 斑節對蝦金屬硫蛋白全基因DNA的克隆

1.3.1 基因組DNA提取和純化 按照海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）使用說明提取合斑節對蝦基因組DNA。按照MicroElute？誖DNA Clean-Up Kit（OMEGA）使用說明純化基因組DNA。

1.3.2 Pm-MT基因內含子擴增 根據已知的Pm-MT基因cDNA全序列（GenBank 登錄號ADQ28316.1），分別在5'UTR和3'UTR區域設計上下游引物SMT（31）和AMT（337）（表1），以斑節對蝦基因組DNA為模板進行PCR擴增。

PCR擴增反應體系：10×Ex Taq Buffer （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 1.5 μL，AMT（337）（10 μmol/L）1 μL，SMT（31）（10 μmol/L）1 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，DNA 1 μL，dH2O 17.25 μL，體系為25 μL。一擴PCR反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 50 s，35 個循環；72 ℃ 8 min；最后4 ℃保溫。

1.3.3 Pm-MT基因啟動子擴增 按照Genome Walking Kit（TaKaRa）的使用說明采用染色體步移的方法擴增Pm-MT基因5′上翼序列。根據已知的Pm-MT DNA序列設計3個特異性引物，分別為AMT（623）、AMT（341）和AMT（84）（表1）。

基因組DNA經純化后，取適量作為模板，以AP Primer（4種AP1 Primer～AP4 Primer）作為上游引物，AMT（623）、AMT（341）和AMT（84）為下游引物，進行PCR反應。

PCR反應體系：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ Plus） 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 8 μL，引物各1 μL，TaKaRa LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，DNA 2 μL，dH2O 32.5 μL，總體系50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，5個循環；94 ℃ 30 s；25 ℃ 3 min；72 ℃ 2 min；根據不同引物使用不同退火溫度和時間。

1.3.4 序列分析 利用啟動子分析軟件BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）（http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）、啟動子結合位點分析TFSEARCH（http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html） 和Alibab2.1（http：//www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）進行分析。

2 結果與分析

2.1 斑節對蝦基因組DNA的提取

使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取斑節對蝦基因組DNA后，取5 μL用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。如圖1所示，DNA片段接近20 kb，主帶清晰，可以滿足后續試驗要求。

2.2 Pm-MT內含子擴增結果

以5′UTR和3′UTR區域的上下游引物SMT（31）和AMT（337）進行PCR擴增，結果如圖2所示。由圖2可知，所得Pm-MT內含子條帶在2 000 bp左右。

2.3 染色體步移結果

由圖3可知，染色體步移PCR中，以AMT（623）、AP1-AP4為引物，擴增結果AP1-AP4對應均有明顯條帶；以AMT（341）為引物，擴增后AP1、AP2和AP3對應均有明顯條帶，而AP4的條帶很弱；最后以AMT（84）為引物，只有AP2和AP3對應有明顯條帶，最大的清晰條帶在1 000 bp左右。

2.4 Pm-MT基因DNA序列及啟動子序列分析

選取染色體步移以AMT（84）進行PCR的明顯條帶，經切膠回收、克隆測序后進行序列分析。在測序結果中可找到特異性引物AMT（84），將此段序列與Pm-MT基因cDNA上游序列進行比對，確定兩條序列對應部分一致。將克隆測序得到Pm-MT基因啟動子序列806 bp、內含子擴增測序所得序列1 730 bp和Pm-MT cDNA序列502 bp拼接后獲得基因組DNA全長（圖4），該基因序列DNA全長為2 744 bp，由2個內含子和3個外顯子組成，其中啟動子區域為806 bp，2個內含子長度分別為1 194、242 bp， 3個外顯子長度分別為22、78、77 bp。Pm-MT基因的外顯子和內含子接頭區符合手提拼接點和供體拼接點的Chambon法則（GT-AG法則）。

利用啟動子分析軟件BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）可預測到2個啟動子序列分別位于-130～-81 bp處（TGCATAAATATATAAAAGATTAGTT

TCAGTTCAATCGTTAAAAGCTTAAC）和-38～12 bp處（CTTACGTCAATATAAACATTGTACACGTGGTGT

CCGACACAGAAGCTCAA）。

利用啟動子結合位點分析軟件TFSEARCH和Alibab2.1預測，可得到Pm-MT啟動子區域包含2個TATA盒，分別位于轉錄起始位點上游-301～-295 bp處和-122～-114 bp處，無GC盒和CAAT盒。該基因啟動子區還包含組成型表達轉錄因子Sp1、基因上游激活因子USF、增強子AP1和Oct-1、轉錄激活因子ATF、聚合酶相關蛋白RAP1、轉錄因子調控元件CRE-BP1、糖皮質激素應答元件GRE、熱休克應答元件轉錄因子HSF、血清應答元件轉錄因子SRF、雌激素應答元件ERE，以及C/EBPalp、E4、C/EBPbeta、Antp、Ftz、YY1等潛在轉錄因子結合位點。

3 討論

為進一步探討Pm-MT與卵巢發育調控的關系，利用染色體步移技術和普通PCR技術相結合的方法，獲得了Pm-MT基因的DNA全長序列，含3個外顯子、2個內含子，與其他動物的MT基因基本一致[17]。不過，斑節對蝦MT基因第一個內含子為1 194 bp，比一般動物的要長[17]。此外，斑節對蝦MT基因內含子的兩側都具有RNA正確剪接所必須的識別位點（GT/AG），這與其他基因的內含子識別序列完全一致。

Pm-MT基因與斑節對蝦的CHH基因[18，19]及中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因[20]DNA組成結構相類似，均含有與其他真核基因相似的啟動子元件特征，包括TATA盒，cAMP效應元件結合蛋白CREB、Pit-1和AP-1等3個反應原件結合蛋白的結合位點。糖皮質激素應答元件GRE是MT基因內對甾體激素產生應答的元件，斑節對蝦MT基因也含有。GRE通過與糖皮質激素受體結合體（glucocorticoid receptor，GR）結合，由此介導甾體激素對MT的誘導[21]。李文佼[22]利用克隆78 bp的人絨毛膜滋養細胞11β-羥基類固醇脫氫酶1型（11β-HSD1）基因啟動子構建于含熒光素酶報告基因的質粒中，轉染WISH細胞株，研究糖皮質激素啟動子活性的機制。結果表明，皮質醇對WISH細胞11β-HSD1表達的調節作用是通過其基因啟動子區實現的；皮質醇對11β-HSD1基因啟動子活性的促進作用可能是通過翻譯起始點上游78 bp的序列實現的，而且與糖皮質激素受體有關。萬順倫[23]利用大鼠海馬11β-HSD1啟動子區，構建以CAT酶為報告基因的pBLCAT6質粒并轉染PC12細胞株，研究結果表明妊娠期糖皮質激素對海馬神經元11β-HSD1表達的上調作用是通過MR和GR（以GR為主）和11β-HSD1啟動子區實現的。據此可推論，Pm-MT的表達受體內甾體激素調控，并可能參與斑節對蝦卵巢發育及生殖活動。根據軟件Alibab2.1預測，Pm-MT基因啟動子區域還含有雌激素應答元件ERE（estrogen responsive element）。Govind等[24]研究得到，雌激素與核受體ER結合，ER即形成二聚體，并與靶基因啟動子序列內的增強子序列——雌激素應答元件ERE結合而誘導靶基因表達。雌激素是甾體激素，且預測中Pm-MT啟動子區域的糖皮質激素應答元件和雌激素應答元件序列重合，提高了Pm-MT的表達受體內甾體激素調控此推測的可信度。而進一步確認Pm-MT表達與甾體激素調控的關系，需進行功能性研究。

胰高血糖素、血管緊張素、糖皮質激素均可誘導鼠、兔和家貓肝腎等器官金屬硫蛋白的合成[13]。本研究根據Pm-MT基因在啟動子區域的分析，推測Pm-MT在斑節對蝦中的表達與CHH家族激素、甾體激素的調控相關。本推測與劉代成等[13]研究結論相似，為今后進一步研究該基因在斑節對蝦卵巢發育中的作用提供了基礎數據。

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