NaCl脅迫下γ—氨基丁酸對兜唇石斛組培苗生長的影響

鄧林霞+陳小強+覃美運+張亞鶴

摘要：以兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]試管苗為材料，探討在不同濃度NaCl脅迫下，不同濃度外源GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響，通過測定兜唇石斛組培苗葉片中的脯氨酸含量來確定外源GABA對鹽脅迫的緩解效應。結果表明，在相同濃度的NaCl脅迫下，加入GABA可明顯提高兜唇石斛組培苗中的脯氨酸含量，說明外源GABA對兜唇石斛組培苗鹽脅迫有明顯的緩解效應，且緩解效果最佳的外源GABA濃度為7 mmol/L。

關鍵詞：兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]；NaCl脅迫；脯氨酸；γ-氨基丁酸

中圖分類號：R282；Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0579-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.048

Effects of Gamma Aminobutyric Acid on the Growth of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher Seedlings under NaCl Stress

DENG Lin-xia，CHEN Xiao-qiang，QIN Mei-yun，ZHANG Ya-he

（College of Agronomy & Resources and Environment， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，China）

Abstract： The seedlings of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher were used as materials to study the different concentrations of NaCl stress， effects of different concentrations of exogenous GABA on the growth of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher plantlets. The rusults showed that the content of the proline from seedlings in leaves of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher would determine exogenous GABA on salt stress relieving effects. Finally， in the same concentration of NaCl stress conditions， exogenous GABA would significantly improve the proline content in Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher seedlings. And the optimal concentration of exogenous GABA was 7 mmol/L.

Key words： Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher； NaCl stress； proline； gamma aminobutyric acid

石斛來源于蘭科石斛屬多種植物的新鮮或干燥莖，是中國歷史悠久的名貴中藥材，具有益脾生津，滋陰清熱的功效，主治熱病傷津、胃痛干嘔、肺燥干咳、腰膝軟弱等癥狀[1，2]?，F代藥理試驗證明，石斛具有抗腫瘤、免疫調節、抗氧化等多種活性[3-5]。兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]屬于蘭科（Orchidaceae）植物，分布于中國長江以南（廣西、云南、貴州）、尼泊爾、錫金、不丹、印度東北部至中南半島和馬來西亞[6]；生長在400～1 500 m的疏林樹干上或山谷巖石上[7]。

兜唇石斛有重要的觀賞價值和較高的藥用價值。近年來，由于森林砍伐嚴重、藥用開發過多等因素，自然界中石斛蘊藏量逐年減少[8]。且石斛生長速度緩慢，加上繁殖率低等特點，許多優良品種無法大量繁殖以滿足日益增長的市場需求。針對這一問題，利用組織培養技術可以擴大石斛蘭生產規模。土壤鹽漬化是農作物生產中最嚴重的非生物逆境之一，選育耐鹽作物，提高作物對鹽漬環境的適應能力，是減輕土壤鹽漬化危害的重要途徑之一。因此，研究植物耐鹽性是植物耐鹽育種的基礎。目前，石斛的生產多利用設施農業通過溫室栽培大量培養，而溫室的環境相對封閉，室內的溫度較高，導致基質水分大量蒸發，鹽分含量增高，不利于兜唇石斛生長發育。所以，研究提高作物耐鹽堿性的方法與機理有重要意義。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，簡稱GABA）又稱γ-氨酪酸，是一種非蛋白質組成的天然氨基酸，分布廣泛；具有降低血壓、控制哮喘、治療癲癇等功能[9]。研究表明，植物體內γ-氨基丁酸（GABA）能在一定程度上增強逆境脅迫下植物的抗性。鹽脅迫條件下GABA對甜瓜[10]、玉米[11]、小麥[12]等的影響已有報道，對GABA緩解兜唇石斛鹽脅迫傷害的研究鮮見報道。在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。本研究通過對不同濃度NaCl脅迫下，不同濃度外源GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響進行分析，建立最適宜兜唇石斛生長的組織培養體系；同時通過測定兜唇石斛組培苗葉片中的脯氨酸含量來確定外源GABA對鹽脅迫的緩解效應，篩選出緩解效果最佳的外源GABA濃度，進而為外源GABA引導兜唇石斛抗逆栽培提供理論基礎，為石斛抗逆栽培和抗性育種研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為兜唇石斛試管苗，取自天津農學院農學與資源環境學院植物細胞工程研究中心。

1.2 方法

1.2.1 兜唇石斛苗的擴繁 取兜唇石斛試管苗接種于新的培養基中，培養基配方為MS+15 g蔗糖+6.5 g瓊脂+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA。為保證后續試驗所需材料的數量，共培養60瓶，每瓶接種3個種苗，每個種苗高2 cm左右。

1.2.2 NaCl脅迫下GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響 設置NaCl的濃度梯度0.4%、0.6%、0.8%，分別加入不同濃度的GABA（0、1、3、5、7、9 mmol/L）（表1），每組配比重復5次。觀察培養30 d，通過測定各個濃度配比中組培苗葉片內的脯氨酸含量來確定外源GABA對鹽脅迫的緩解效應。

1）制作脯氨酸標準曲線。按照脯氨酸含量的測定方法[13，14]，以脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=0.023 6x+0.001 3（R2=0.988 2），如圖1所示。

2）樣品測定。稱取0.5 g兜唇石斛葉片放到具塞試管中（3次重復），加入5 mL 3%的5-磺基水楊酸溶液，沸水浴10 min，冷卻后吸取上清液。具塞試管中加入2 mL上清液，2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，進行沸水浴30 min。冷卻后向具塞試管中加入4 mL的甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。在3 000 r/min下離心5 min，靜置分層后吸取甲苯層，以甲苯溶液為對照，在分光光度計520 nm波長下比色，測得各處理下試管苗中脯氨酸的吸光度。

根據回歸方程計算出2 mL測定液中脯氨酸的含量，然后計算樣品中脯氨酸含量百分數。計算公式如下[14]：

脯氨酸（μg/g FW或DW）=（C×V/a）/W （1）

式中，C為提取液中脯氨酸含量（μg），由標準曲線求得；V為提取液總體積（mL）；a為測定時所吸取提取液的體積（mL）；W為樣品質量（g）。

2 結果與分析

2.1 兜唇石斛苗的擴繁

經過50 d的觀察，兜唇石斛的生長狀況如圖2所示。培養過程中兜唇石斛污染率為0，死亡率為3.25%。在培養基MS+15 g蔗糖+6.5 g瓊脂+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養條件下組培苗的長勢最好，葉色由剛開始培養的淡綠變為深綠，植株健壯且無病害。

2.2 NaCl脅迫下GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響

在逆境條件下，植物體內的脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸是植物體內的一種重要調節物質[15]，植物通過不斷積累脯氨酸來適應不同的鹽堿環境。因此，不同濃度NaCl脅迫下，兜唇石斛苗體內的脯氨酸含量不同。為避免分光光度計測量值造成誤差，在測量組培苗中脯氨酸含量前，先繪制脯氨酸的標準曲線，得到脯氨酸濃度（X）與吸光度（Y）的回歸方程Y=0.068 1X+0.006 4（R2=0.988 2）。用分光光度計測定組培苗脯氨酸提取液的吸光度，代入回歸方程得出不同處理下兜唇石斛組培苗體內所含的脯氨酸濃度；將得到的脯氨酸濃度再代入公式（1），得到脯氨酸含量。加入GABA后，不同NaCl濃度處理下兜唇石斛組培苗葉片內的吸光度、脯氨酸濃度和脯氨酸含量如表2所示。此培養過程中兜唇石斛組培苗的污染率為4.0%，死亡率為7.35%。

由于植物體內GABA能在一定程度上增強逆境脅迫下植物的抗性，由表2中所得數據對比后發現，在相同濃度的NaCl脅迫條件下，加入GABA可顯著提高兜唇石斛組培苗中脯氨酸含量，說明外源GABA對兜唇石斛組培苗有明顯的緩解效應。

圖3為不同濃度NaCl脅迫下，不同濃度GABA對兜唇石斛組培苗葉片內脯氨酸含量的影響。由圖3可看出，在相同NaCl濃度脅迫下，組培苗葉片內的脯氨酸含量在一定程度上呈上升趨勢；不同NaCl濃度脅迫下，隨著GABA濃度的上升，脯氨酸的含量逐漸上升，并在7 mmol/L時達到最高，然后開始下降；在NaCl脅迫的條件下，緩解兜唇石斛組培苗鹽脅迫效果最佳的外源GABA濃度為7 mmol/L。

3 小結與討論

3.1 兜唇石斛的擴繁

外源激素對于兜唇石斛組織培養有著顯著影響，6-BA是細胞分裂類激素，有利于細胞的分化及出芽[16，17]。NAA是生長素類激素，對于植物體的生根有重要作用[18]。在MS培養基的基礎上加入適宜濃度的6-BA和NAA，可使組培苗生長得更快。

3.2 NaCl脅迫下GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響

逆境脅迫下，GABA作為一種特殊的氨基酸，與植物體內碳素和氮素兩大代謝途徑密切相關，而且外源GABA能夠通過參與植株體內活性氧代謝，在調節植物細胞對逆境的適應過程中發揮重要作用[19]。植物遇到生理脅迫和病蟲害等逆境條件時，體內的GABA含量會迅速增加[20-22]。正常條件下，植物組織中GABA的內源水平在0.03～32.5 μmol/g（FW），而當植物受到環境脅迫（缺氧、冷害、熱刺激以及機械損傷等）時，體內GABA含量會增加幾倍或幾十倍[23，24]。羅黃穎等[25]研究了外源GABA浸種處理對NaCl脅迫下番茄種子萌發及幼苗生長和生理代謝的影響，結果表明，外源GABA浸種處理能夠通過促進番茄種子萌發和幼苗生長緩解鹽脅迫的傷害，其中10 mmol/L處理效果較好。趙九洲等[10]研究表明，當GABA噴施濃度在25～50 mmol/L時，對鹽堿脅迫下甜瓜幼苗生長有一定緩解作用，其中50 mmol/L緩解鹽堿脅迫效果最好，而75 mmol/LGABA無有效緩解作用。田小磊等[11]以玉米黃化幼苗為材料，分析在鹽脅迫條件下外源GABA對玉米種子萌發和幼苗生長的影響，推斷GABA可通過提高保護酶系統活性緩解鹽脅迫對植物的傷害。李巖巖[12]通過分析GABA對小麥生長狀況及其生理生化產生的影響，推斷出GABA能提高小麥的耐鹽性。

本試驗研究不同濃度外源GABA對兜唇石斛組培苗在不同濃度NaCl脅迫下的緩解效應，結果表明，在相同濃度NaCl脅迫下，加入GABA可顯著提高兜唇石斛組培苗中脯氨酸含量，說明外源GABA對兜唇石斛組培苗有明顯的緩解效應；在不同NaCl濃度脅迫下，隨著外源GABA濃度的升高，脯氨酸含量逐漸上升，并在7 mmol/L時達到最高，然后開始下降。因此，在NaCl脅迫下，緩解兜唇石斛組培苗鹽脅迫效果最佳的外源GABA濃度為7 mmol/L。

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