生長素和脫落酸在草莓果實發育過程中的作用

賈海鋒+趙密珍+王慶蓮

摘要：草莓果實是非呼吸躍變型果實，關于其發育成熟的機理研究較少。以八倍體草莓甜查理為試材，分析了果實發育過程中脫落酸ABA和生長素IAA的含量，同時用ABA和IAA處理轉色期的草莓果實，發現ABA能加速果實著色軟化，抑制IAA的積累；相反IAA抑制果實著色軟化，抑制ABA的積累。進一步分析表明ABA能降低IAA合成代謝路徑中基因的表達水平，而IAA能降低ABA合成代謝路徑中基因的表達水平。ABA能促進果實成熟相關基因的表達，包括與果實上色有關的基因如查爾酮合酶等，和與果實軟化有關的基因如伸展蛋白基因等；但IAA表現為抑制。果實上色與軟化直接影響草莓成熟進程。這些結果說明ABA和IAA協同調控了草莓果實的發育進程，為以后草莓果實品質的改善和育種提供了思路。

關鍵詞：草莓果實；脫落酸；生長素；基因表達

中圖分類號：S668.404；S482.8 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2016）11-0173-04

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是一種重要的鮮食和加工水果，具有可口的風味和豐富的營養成分[1]。草莓在成熟過程中無特定的呼吸峰和乙烯峰，由于其有體積小、易于傳代、營養生長期短和果實生長迅速（果實成熟只需要1個月左右）的特點，草莓因此成為研究非呼吸躍變型果實成熟機理的模式植物[2-3]，也是大規模的番茄成熟機理研究之后把大量有關成熟基因用于基因功能分析和轉基因研究的又一重要的水果種類[4-5]。目前大多數研究認為，草莓屬于典型的非呼吸躍變型果實[6-7]。植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）不僅能促進草莓果實對糖的吸收[8-9]，而且在草莓果實成熟調控過程中發揮重要的作用[6，10-12]。ABA在其他非呼吸躍變型果實中也起著核心作用，比如在櫻桃果實成熟過程中，ABA參與了果實的生長發育與成熟；柑橘成熟過程中積累了大量的ABA；并且越來越多的研究也表明，ABA參與果實發育和成熟過程的調控[13]。與大量的關于ABA對果實成熟調控的報道不同，作為一個經典的植物激素——生長素（auxin，IAA）的作用并未在果實發育過程中有過多的研究。IAA與ABA作用相反，能延遲植物的衰老死亡。很多的證據表明，在果實的后熟過程中，果實全熟前IAA的含量持續下降直到最低水平為止。陳昆松等分析認為獼猴桃果實中內源IAA的含量隨著果實的成熟呈下降趨勢，隨著IAA含量的下降，開始出現乙烯躍變峰[14]。用IAA處理獼猴桃果實能促進內源IAA的積累，使ABA水平下降，推遲ABA峰值出現，最后延遲果實的軟化成熟。在許多果實中，成熟總是伴隨著IAA含量的下降。田建文等研究柿子中激素含量的變化也得出了同樣的結果[15]。因此，他們認為果實在完全成熟前，IAA必須先經過氧化以降低在果實中的含量，果實才能成熟。周麗萍等的研究也認為IAA水平的下降可以導致細胞對乙烯更為敏感[16]；IAA可使呼吸躍變型果實延遲成熟，果實開始全熟是由于IAA失去了激素的作用所致，但其機理并不清楚。

本研究通過對甜查理草莓果實成熟過程中內源ABA和IAA含量的動態變化，外源ABA和IAA處理對草莓果實成熟的影響，對ABA和IAA與草莓果實成熟的關系進行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為杜克拉草莓（Fragaria×ananassa‘sweet charlie），于2014年取自江蘇省農業科學院試驗基地。采集花后7～28 d的果實，參照文獻[17]，將果實劃分為 7個時期：小綠（幼果期，花后7 d）、大綠（大果期，花后14 d）、淺綠（綠熟期，花后18 d）、純白（白熟期，花后21 d）、始紅（始熟期，花后 23 d）、片紅（轉色期，花后25 d）、全紅（成熟期，花后 28 d）。每個時期樣品設置3個重復。摘取鮮樣后立即用刀片將果肉與種子分離，收集果肉液氮冷凍，貯存于-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京博邁德科技發展有限公司）提取草莓果實中的總RNA。以提取的總RNA為模板，利用Clontech SMARTTM Library試劑盒（美國Clontech公司）合成cDNA第一鏈用于擴增基因片段。

1.3 草莓果肉中ABA含量和IAA含量的測定

用酶聯免疫法測定果肉中ABA和IAA含量。從冰箱中取各時期果肉，稱取0.5～1.0 g樣品，加入提取液，于冰浴中研磨勻漿，轉入10 mL試管中，分次用2 mL提取液沖洗研缽，一并轉入試管中，搖勻置于4 ℃冰箱中浸提4 h后1 000 g離心15 min，收集上清，沉淀中加入1 mL提取液搖勻，4 ℃浸提1 h后1 000 g離心15 min，合并上清并記錄體積，棄去殘渣，將上清轉入5 mL塑料離心管中，氮氣吹干，除去甲醇，用樣品稀釋液定容待測樣品。具體測定程序按照中國農業大學出售試劑盒操作說明進行。ABA和IAA含量通過美國BioTek公司生產的ELx800TM通用酶標儀測定，試驗重復3次。

1.4 實時熒光定量PCR分析

對7個時期樣品分別提取總RNA，并加入DNaseⅠ酶去除DNA污染，體系為2 μL DNA酶、45 μL總RNA和5 μL DNaseⅠ酶buffer。37 ℃放置12～15 min，然后用RNA清潔試劑盒純化RNA（北京博邁德科技發展有限公司），并使用MMLV First cDNA Synthesis Kit（上海生物工程技術服務有限公司）合成第一鏈cDNA，利用軟件Primer 5設計熒光引物。引物序列見表1。

以ACTIN為內參基因，按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（寶生物工程有限公司）操作指導，采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）的方法，檢測基因的相對表達量。

對反轉錄所得的cDNA分別進行5個梯度稀釋（1、10-1、10-2、10-3、10-4），實施熒光定量PCR反應，然后繪制相對標準曲線。相關基因和內參ACTIN基因RT-qPCR擴增的總反應體系為20 μL，包括10 μL SYBR Premix Ex Taq混合液、2 μL cDNA、0.4 μL上游引物（10 μmol/L）、0.4 μL下游引物（10 μmol/L）、7.2 μL無核酸污染的滅菌水。反應程序為 94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。每次循環第3步進行熒光采集。最后從60 ℃升溫至95 ℃，每隔30 s上升0.5 ℃，總共71個循環。檢測其熒光值，繪制熔點曲線。3次重復。

1.5 數據分析

試驗數據利用Excel 2000和DPS 6.50軟件進行分析，用DPS程序中的Duncans新復極差測驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 草莓果實發育過程中ABA和IAA含量的變化

為了檢測IAA和ABA含量在甜查理草莓果實發育中的變化，本試驗將草莓果實劃分為7個時期。從圖1可以看出，果肉中ABA含量在整個草莓果實發育過程中出現2個上升階段，即從幼果期至白熟期和始熟期至成熟期；二者之間變化不大的是白熟期至始熟期。揭示了ABA含量快速積累不僅伴隨著果實的膨大和褪綠，而且伴隨著果實的著色，說明ABA含量與草莓果實發育和成熟有密切的關系。與ABA含量變化趨勢相反，IAA含量從小綠果到大綠果急劇上升，但是大綠果到純白果含量急速下降，純白果到始紅果IAA含量變化不大，隨后到紅果又出現了下降，IAA含量變化趨勢與果實成熟進程相反，說明IAA含量與草莓果實發育呈現負相關。

2.2 ABA和IAA處理對果實的影響

為了進一步證明ABA和IAA在草莓果實中的作用，利用50 μmol/L的ABA和IAA處理大綠果時期的草莓果實，結果（圖2）表明，與水處理的果實相比（對照），ABA能促進草莓果實的著色軟化，使花色苷含量上升和果實硬度下降，果實內IAA的含量也出現了下降；相反，IAA抑制了果實花色苷的積累和果實的軟化，并且降低了ABA的含量，延遲了果實的成熟進程（圖3）。

2.3 ABA和IAA的相互作用對成熟相關基因的影響

ABA能通過降低IAA合成路徑中基因的表達量進而阻止IAA的積累，比如IAA轉運基因FaPIN（auxin transporter gene）和合成基因FaYUCCA（flavin monooxygenase gene）。IAA也能使ABA合成路徑中基因的表達量降低進而使ABA含量下降，比如FaNCED和FaBG（圖3）。ABA和IAA還能誘導或阻止果實成熟相關基因的表達，比如與花色苷合成相關的基因，查爾酮合酶基因CHS（chalcone synthase）、查爾酮異構酶基因CHI（chalcone isomerase）、黃烷酮3-羥化酶基因F3H（flavanone 3-hydroxylase）、UDP葡萄糖-類黃酮-3-O-葡萄糖基轉移酶基因UFGT（UDP-glycose flavonoid 3-O-glycosyltransgerase）、二氫黃酮醇還原酶基因DFR（dihydroflavonol-4-reductase）和與果實軟化有關的基因，伸展蛋白基因EXP1（expansion）、聚半乳糖醛酸酶基因PG（polygalacturonase）、果膠裂解酶基因PL（pectate lyase）、葡聚糖酶基因EG（endo-1，4-b-glucanase）（圖4）。

3 結論與討論

根據果實成熟的特點，果樹果實可分為2個基本類型，即呼吸躍變型果實和非呼吸躍變型果實[18-20]。呼吸躍變型果實成熟的“調控因素”就是植物激素乙烯，如番茄、香蕉、蘋果。非呼吸躍變型果實的成熟主要受植物激素ABA的調控，在非呼吸躍變型果實的成熟過程中只有少量的乙烯產生，而且乙烯的峰值一般是在激素ABA的峰值之后，如葡萄、柑橘和草莓。迄今為止人們對乙烯對果實成熟機理的調控研究已取得了很大的進展，但是關于非呼吸躍變型果實的成熟機制仍未闡明。ABA作為一種植物激素，已證實不僅在調控植物休眠衰老和抗逆境脅迫等過程中起著重要的作用，而且是調控果實尤其是非呼吸躍變型果實發育的關鍵因素[7，21]。本研究發現在甜查理草莓果實中ABA含量是隨著果實發育上升的，有2個明顯的上升期，第1個是果實褪綠變白期，第2個是果實上色期。果實的生長發育是指從開花到果實衰老的全過程，在這一過程中除受到乙烯和ABA的調控外，還受到其他激素的調控，如IAA、赤霉素（GA）、細胞分裂素（CTK）等激素的影響。IAA是第一種被確認的植物激素，在某些非呼吸躍變型果實的成熟過程中起抑制作用[22-23]。在草莓中，由瘦果（種子）分泌的IAA會抑制肉質花托的成熟[8，24]。隨著植株的發育，瘦果和花托的IAA水平會逐漸低于臨界水平從而使果實成熟。因此去除瘦果可以促進成熟，而施用外源IAA則會使草莓延遲成熟。本研究也表明，隨著果實的發育，IAA含量在小綠果時期很高，但是與ABA含量變化進程相反，在果實褪綠時期，IAA含量急劇下降，在紅果時期，含量降到最低點。這說明IAA含量的變化與草莓果實發育呈負相關（圖1）。并且本研究結果也表明，在大綠果時期用IAA處理草莓果實，會延遲果實上色，花色苷積累減緩，內源ABA含量降低。而ABA處理后的草莓果實，與對照相比，能提前著色，促進花色苷積累，同時也降低了IAA含量。這說明ABA和IAA互相影響，產生拮抗（圖2）。草莓果實成熟是ABA含量升高導致的結果，還是IAA含量降低導致的結果，是因為正的調控因子ABA還是負的調控因子IAA起主要作用，還需要深入研究。

ABA和IAA的拮抗作用是因為二者能互相抑制對方的生物合成代謝途徑。草莓果實噴施外源ABA能抑制果實內IAA合成路徑中基因的表達，比如IAA合成酶的FaYUCCA基因和IAA轉運酶的FaPIN基因。同樣IAA也能抑制ABA合成路徑中基因的表達，比如FaBG和FaNCED。ABA和IAA除了能互相影響外（圖3），它們還能調控與果實成熟相關基因的表達，比如ABA和IAA能促進或抑制與花色苷合成相關基因、與果實軟化相關基因的表達（圖4）。這說明ABA和IAA能協同調控果實的發育，含量高的ABA能促進果實成熟進程，使果實衰老得更快，但是高的IAA含量能延遲果實衰老，使果實保持新鮮的狀態。因此，ABA和IAA含量的調控為果實品質的形成和果實保鮮的研究提供了一個方向。

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