生長素和脫落酸在草莓果實(shí)發(fā)育過程中的作用

賈海鋒+趙密珍+王慶蓮

摘要：草莓果實(shí)是非呼吸躍變型果實(shí)，關(guān)于其發(fā)育成熟的機(jī)理研究較少。以八倍體草莓甜查理為試材，分析了果實(shí)發(fā)育過程中脫落酸ABA和生長素IAA的含量，同時用ABA和IAA處理轉(zhuǎn)色期的草莓果實(shí)，發(fā)現(xiàn)ABA能加速果實(shí)著色軟化，抑制IAA的積累；相反IAA抑制果實(shí)著色軟化，抑制ABA的積累。進(jìn)一步分析表明ABA能降低IAA合成代謝路徑中基因的表達(dá)水平，而IAA能降低ABA合成代謝路徑中基因的表達(dá)水平。ABA能促進(jìn)果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，包括與果實(shí)上色有關(guān)的基因如查爾酮合酶等，和與果實(shí)軟化有關(guān)的基因如伸展蛋白基因等；但I(xiàn)AA表現(xiàn)為抑制。果實(shí)上色與軟化直接影響草莓成熟進(jìn)程。這些結(jié)果說明ABA和IAA協(xié)同調(diào)控了草莓果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程，為以后草莓果實(shí)品質(zhì)的改善和育種提供了思路。

關(guān)鍵詞：草莓果實(shí)；脫落酸；生長素；基因表達(dá)

中圖分類號：S668.404；S482.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2016）11-0173-04

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是一種重要的鮮食和加工水果，具有可口的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)成分[1]。草莓在成熟過程中無特定的呼吸峰和乙烯峰，由于其有體積小、易于傳代、營養(yǎng)生長期短和果實(shí)生長迅速（果實(shí)成熟只需要1個月左右）的特點(diǎn)，草莓因此成為研究非呼吸躍變型果實(shí)成熟機(jī)理的模式植物[2-3]，也是大規(guī)模的番茄成熟機(jī)理研究之后把大量有關(guān)成熟基因用于基因功能分析和轉(zhuǎn)基因研究的又一重要的水果種類[4-5]。目前大多數(shù)研究認(rèn)為，草莓屬于典型的非呼吸躍變型果實(shí)[6-7]。植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）不僅能促進(jìn)草莓果實(shí)對糖的吸收[8-9]，而且在草莓果實(shí)成熟調(diào)控過程中發(fā)揮重要的作用[6，10-12]。ABA在其他非呼吸躍變型果實(shí)中也起著核心作用，比如在櫻桃果實(shí)成熟過程中，ABA參與了果實(shí)的生長發(fā)育與成熟；柑橘成熟過程中積累了大量的ABA；并且越來越多的研究也表明，ABA參與果實(shí)發(fā)育和成熟過程的調(diào)控[13]。與大量的關(guān)于ABA對果實(shí)成熟調(diào)控的報(bào)道不同，作為一個經(jīng)典的植物激素——生長素（auxin，IAA）的作用并未在果實(shí)發(fā)育過程中有過多的研究。IAA與ABA作用相反，能延遲植物的衰老死亡。很多的證據(jù)表明，在果實(shí)的后熟過程中，果實(shí)全熟前IAA的含量持續(xù)下降直到最低水平為止。陳昆松等分析認(rèn)為獼猴桃果實(shí)中內(nèi)源IAA的含量隨著果實(shí)的成熟呈下降趨勢，隨著IAA含量的下降，開始出現(xiàn)乙烯躍變峰[14]。用IAA處理獼猴桃果實(shí)能促進(jìn)內(nèi)源IAA的積累，使ABA水平下降，推遲ABA峰值出現(xiàn)，最后延遲果實(shí)的軟化成熟。在許多果實(shí)中，成熟總是伴隨著IAA含量的下降。田建文等研究柿子中激素含量的變化也得出了同樣的結(jié)果[15]。因此，他們認(rèn)為果實(shí)在完全成熟前，IAA必須先經(jīng)過氧化以降低在果實(shí)中的含量，果實(shí)才能成熟。周麗萍等的研究也認(rèn)為IAA水平的下降可以導(dǎo)致細(xì)胞對乙烯更為敏感[16]；IAA可使呼吸躍變型果實(shí)延遲成熟，果實(shí)開始全熟是由于IAA失去了激素的作用所致，但其機(jī)理并不清楚。

本研究通過對甜查理草莓果實(shí)成熟過程中內(nèi)源ABA和IAA含量的動態(tài)變化，外源ABA和IAA處理對草莓果實(shí)成熟的影響，對ABA和IAA與草莓果實(shí)成熟的關(guān)系進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為杜克拉草莓（Fragaria×ananassa‘sweet charlie），于2014年取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。采集花后7～28 d的果實(shí)，參照文獻(xiàn)[17]，將果實(shí)劃分為 7個時期：小綠（幼果期，花后7 d）、大綠（大果期，花后14 d）、淺綠（綠熟期，花后18 d）、純白（白熟期，花后21 d）、始紅（始熟期，花后 23 d）、片紅（轉(zhuǎn)色期，花后25 d）、全紅（成熟期，花后 28 d）。每個時期樣品設(shè)置3個重復(fù)。摘取鮮樣后立即用刀片將果肉與種子分離，收集果肉液氮冷凍，貯存于-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京博邁德科技發(fā)展有限公司）提取草莓果實(shí)中的總RNA。以提取的總RNA為模板，利用Clontech SMARTTM Library試劑盒（美國Clontech公司）合成cDNA第一鏈用于擴(kuò)增基因片段。

1.3 草莓果肉中ABA含量和IAA含量的測定

用酶聯(lián)免疫法測定果肉中ABA和IAA含量。從冰箱中取各時期果肉，稱取0.5～1.0 g樣品，加入提取液，于冰浴中研磨勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL試管中，分次用2 mL提取液沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻置于4 ℃冰箱中浸提4 h后1 000 g離心15 min，收集上清，沉淀中加入1 mL提取液搖勻，4 ℃浸提1 h后1 000 g離心15 min，合并上清并記錄體積，棄去殘?jiān)瑢⑸锨遛D(zhuǎn)入5 mL塑料離心管中，氮?dú)獯蹈桑ゼ状迹脴悠废♂屢憾ㄈ荽郎y樣品。具體測定程序按照中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出售試劑盒操作說明進(jìn)行。ABA和IAA含量通過美國BioTek公司生產(chǎn)的ELx800TM通用酶標(biāo)儀測定，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR分析

對7個時期樣品分別提取總RNA，并加入DNaseⅠ酶去除DNA污染，體系為2 μL DNA酶、45 μL總RNA和5 μL DNaseⅠ酶buffer。37 ℃放置12～15 min，然后用RNA清潔試劑盒純化RNA（北京博邁德科技發(fā)展有限公司），并使用MMLV First cDNA Synthesis Kit（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）合成第一鏈cDNA，利用軟件Primer 5設(shè)計(jì)熒光引物。引物序列見表1。

以ACTIN為內(nèi)參基因，按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（寶生物工程有限公司）操作指導(dǎo)，采用實(shí)時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）的方法，檢測基因的相對表達(dá)量。

對反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA分別進(jìn)行5個梯度稀釋（1、10-1、10-2、10-3、10-4），實(shí)施熒光定量PCR反應(yīng)，然后繪制相對標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)基因和內(nèi)參ACTIN基因RT-qPCR擴(kuò)增的總反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL SYBR Premix Ex Taq混合液、2 μL cDNA、0.4 μL上游引物（10 μmol/L）、0.4 μL下游引物（10 μmol/L）、7.2 μL無核酸污染的滅菌水。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光采集。最后從60 ℃升溫至95 ℃，每隔30 s上升0.5 ℃，總共71個循環(huán)。檢測其熒光值，繪制熔點(diǎn)曲線。3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2000和DPS 6.50軟件進(jìn)行分析，用DPS程序中的Duncans新復(fù)極差測驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓果實(shí)發(fā)育過程中ABA和IAA含量的變化

為了檢測IAA和ABA含量在甜查理草莓果實(shí)發(fā)育中的變化，本試驗(yàn)將草莓果實(shí)劃分為7個時期。從圖1可以看出，果肉中ABA含量在整個草莓果實(shí)發(fā)育過程中出現(xiàn)2個上升階段，即從幼果期至白熟期和始熟期至成熟期；二者之間變化不大的是白熟期至始熟期。揭示了ABA含量快速積累不僅伴隨著果實(shí)的膨大和褪綠，而且伴隨著果實(shí)的著色，說明ABA含量與草莓果實(shí)發(fā)育和成熟有密切的關(guān)系。與ABA含量變化趨勢相反，IAA含量從小綠果到大綠果急劇上升，但是大綠果到純白果含量急速下降，純白果到始紅果IAA含量變化不大，隨后到紅果又出現(xiàn)了下降，IAA含量變化趨勢與果實(shí)成熟進(jìn)程相反，說明IAA含量與草莓果實(shí)發(fā)育呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

2.2 ABA和IAA處理對果實(shí)的影響

為了進(jìn)一步證明ABA和IAA在草莓果實(shí)中的作用，利用50 μmol/L的ABA和IAA處理大綠果時期的草莓果實(shí)，結(jié)果（圖2）表明，與水處理的果實(shí)相比（對照），ABA能促進(jìn)草莓果實(shí)的著色軟化，使花色苷含量上升和果實(shí)硬度下降，果實(shí)內(nèi)IAA的含量也出現(xiàn)了下降；相反，IAA抑制了果實(shí)花色苷的積累和果實(shí)的軟化，并且降低了ABA的含量，延遲了果實(shí)的成熟進(jìn)程（圖3）。

2.3 ABA和IAA的相互作用對成熟相關(guān)基因的影響

ABA能通過降低IAA合成路徑中基因的表達(dá)量進(jìn)而阻止IAA的積累，比如IAA轉(zhuǎn)運(yùn)基因FaPIN（auxin transporter gene）和合成基因FaYUCCA（flavin monooxygenase gene）。IAA也能使ABA合成路徑中基因的表達(dá)量降低進(jìn)而使ABA含量下降，比如FaNCED和FaBG（圖3）。ABA和IAA還能誘導(dǎo)或阻止果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，比如與花色苷合成相關(guān)的基因，查爾酮合酶基因CHS（chalcone synthase）、查爾酮異構(gòu)酶基因CHI（chalcone isomerase）、黃烷酮3-羥化酶基因F3H（flavanone 3-hydroxylase）、UDP葡萄糖-類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因UFGT（UDP-glycose flavonoid 3-O-glycosyltransgerase）、二氫黃酮醇還原酶基因DFR（dihydroflavonol-4-reductase）和與果實(shí)軟化有關(guān)的基因，伸展蛋白基因EXP1（expansion）、聚半乳糖醛酸酶基因PG（polygalacturonase）、果膠裂解酶基因PL（pectate lyase）、葡聚糖酶基因EG（endo-1，4-b-glucanase）（圖4）。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)果實(shí)成熟的特點(diǎn)，果樹果實(shí)可分為2個基本類型，即呼吸躍變型果實(shí)和非呼吸躍變型果實(shí)[18-20]。呼吸躍變型果實(shí)成熟的“調(diào)控因素”就是植物激素乙烯，如番茄、香蕉、蘋果。非呼吸躍變型果實(shí)的成熟主要受植物激素ABA的調(diào)控，在非呼吸躍變型果實(shí)的成熟過程中只有少量的乙烯產(chǎn)生，而且乙烯的峰值一般是在激素ABA的峰值之后，如葡萄、柑橘和草莓。迄今為止人們對乙烯對果實(shí)成熟機(jī)理的調(diào)控研究已取得了很大的進(jìn)展，但是關(guān)于非呼吸躍變型果實(shí)的成熟機(jī)制仍未闡明。ABA作為一種植物激素，已證實(shí)不僅在調(diào)控植物休眠衰老和抗逆境脅迫等過程中起著重要的作用，而且是調(diào)控果實(shí)尤其是非呼吸躍變型果實(shí)發(fā)育的關(guān)鍵因素[7，21]。本研究發(fā)現(xiàn)在甜查理草莓果實(shí)中ABA含量是隨著果實(shí)發(fā)育上升的，有2個明顯的上升期，第1個是果實(shí)褪綠變白期，第2個是果實(shí)上色期。果實(shí)的生長發(fā)育是指從開花到果實(shí)衰老的全過程，在這一過程中除受到乙烯和ABA的調(diào)控外，還受到其他激素的調(diào)控，如IAA、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（CTK）等激素的影響。IAA是第一種被確認(rèn)的植物激素，在某些非呼吸躍變型果實(shí)的成熟過程中起抑制作用[22-23]。在草莓中，由瘦果（種子）分泌的IAA會抑制肉質(zhì)花托的成熟[8，24]。隨著植株的發(fā)育，瘦果和花托的IAA水平會逐漸低于臨界水平從而使果實(shí)成熟。因此去除瘦果可以促進(jìn)成熟，而施用外源IAA則會使草莓延遲成熟。本研究也表明，隨著果實(shí)的發(fā)育，IAA含量在小綠果時期很高，但是與ABA含量變化進(jìn)程相反，在果實(shí)褪綠時期，IAA含量急劇下降，在紅果時期，含量降到最低點(diǎn)。這說明IAA含量的變化與草莓果實(shí)發(fā)育呈負(fù)相關(guān)（圖1）。并且本研究結(jié)果也表明，在大綠果時期用IAA處理草莓果實(shí)，會延遲果實(shí)上色，花色苷積累減緩，內(nèi)源ABA含量降低。而ABA處理后的草莓果實(shí)，與對照相比，能提前著色，促進(jìn)花色苷積累，同時也降低了IAA含量。這說明ABA和IAA互相影響，產(chǎn)生拮抗（圖2）。草莓果實(shí)成熟是ABA含量升高導(dǎo)致的結(jié)果，還是IAA含量降低導(dǎo)致的結(jié)果，是因?yàn)檎恼{(diào)控因子ABA還是負(fù)的調(diào)控因子IAA起主要作用，還需要深入研究。

ABA和IAA的拮抗作用是因?yàn)槎吣芑ハ嘁种茖Ψ降纳锖铣纱x途徑。草莓果實(shí)噴施外源ABA能抑制果實(shí)內(nèi)IAA合成路徑中基因的表達(dá)，比如IAA合成酶的FaYUCCA基因和IAA轉(zhuǎn)運(yùn)酶的FaPIN基因。同樣IAA也能抑制ABA合成路徑中基因的表達(dá)，比如FaBG和FaNCED。ABA和IAA除了能互相影響外（圖3），它們還能調(diào)控與果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，比如ABA和IAA能促進(jìn)或抑制與花色苷合成相關(guān)基因、與果實(shí)軟化相關(guān)基因的表達(dá)（圖4）。這說明ABA和IAA能協(xié)同調(diào)控果實(shí)的發(fā)育，含量高的ABA能促進(jìn)果實(shí)成熟進(jìn)程，使果實(shí)衰老得更快，但是高的IAA含量能延遲果實(shí)衰老，使果實(shí)保持新鮮的狀態(tài)。因此，ABA和IAA含量的調(diào)控為果實(shí)品質(zhì)的形成和果實(shí)保鮮的研究提供了一個方向。

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