銅脅迫下不同茶樹的生理響應及亞細胞水平銅分布特性

王海斌+葉江華+孔祥海

摘要：為了分析不同茶樹對Cu脅迫的生理響應及組織亞細胞Cu分布特性，采用水培法，探討鐵觀音、肉桂2種茶樹在不同濃度Cu脅迫下，茶樹根部、葉部生理響應及其亞細胞Cu分布特征，以期為重金屬對茶樹毒害機制和茶樹對重金屬的自我防御研究提供理論依據。結果表明，隨著Cu脅迫濃度的增加，茶樹根部、葉部SOD、POD、CAT活性呈現下降趨勢，且肉桂對Cu脅迫的耐受性高于鐵觀音。相同濃度Cu脅迫下2種茶樹不同組織亞細胞中的Cu含量根部大于葉片。正常條件下，2種茶樹根部、葉部亞細胞組分中細胞器的Cu含量最高，當脅迫Cu濃度>0 mg/L、≤40 mg/L 時，細胞溶質Cu含量最高，當脅迫Cu濃度>40 mg/L時，細胞壁Cu含量最高。Cu脅迫下，鐵觀音主要采取提高細胞溶質和細胞器中Cu離子含量來降低Cu離子毒害，而肉桂主要以提高細胞壁中Cu離子的結合率來降低Cu離子毒害，可見不同的茶樹在Cu脅迫下所表現的解毒模式存在著一定差異。

關鍵詞：茶樹；銅脅迫；生理特性；亞細胞；分布特征

中圖分類號： X503.235；S571.101 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0219-05

銅（Cu）是植物體內多酚氧化酶、細胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶等多種酶類組成成分之一，是植物生長所需的微量元素[1]。然而，當外界環境存在較大量的Cu時，植物根系吸收Cu離子后，在植物體內轉運，分布并積累于不同的部位，進而導致植物攝入過量Cu，生長受阻[2-3]。

眾多學者開展了大量研究，探討重金屬脅迫對植物生長的影響，并普遍認為高劑量重金屬對植物生長產生一定的毒害作用[4-6]。植物吸收的重金屬離子進入植物組織細胞，對植物細胞產生直接性的毒害，是影響植物生長的關鍵，不同的植物細胞中重金屬分布特征存在著一定的差異[7-8]。例如，錳在對商陸產生脅迫時，其主要分布在商陸葉片的細胞質可溶性部分，細胞壁次之，細胞器最少[9]。番茄在銅脅迫下，主要以提高細胞壁和細胞溶質中的銅含量來降低銅離子毒害[10]。在鉛、鎘脅迫下，萱草對鉛的解毒方式主要采用提高細胞溶質鉛含量的方法降低毒性，而對于鎘則以提高細胞壁中鎘含量的方法降低毒性[11]。可見，植物在吸收過量重金屬離子后，通過自身特有的生理機制對過量重金屬進行轉化降低毒性以達到抵抗重金屬脅迫的效果。

近年來，茶葉經濟效益提升，為了有效保證茶葉的產量，茶園中含金屬的化肥、農藥、有機肥等大量施用，一方面導致茶園土壤重金屬含量增加，另一方面引起茶樹體內重金屬元素積累量提升[12-14]。長期以來眾多學者主要集中探討茶葉成品加工后重金屬的溶出率、重金屬對茶樹生長的影響，茶樹重金屬的累積特性等[15-17]，而對于茶樹受到重金屬脅迫后，金屬離子在茶樹體內的積累及形態變化未作深入的研究。本研究以福建著名的茶樹品種鐵觀音、肉桂為研究對象，探討不同濃度Cu脅迫下，2種茶樹響應Cu脅迫的生理特性及其亞細胞Cu分布特征，以期為研究重金屬對茶樹毒害機制和茶樹對重金屬的自我防御提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

福建安溪鐵觀音1年生無性系茶苗，茶苗高度35 cm左右，主莖直徑約4.2 mm；福建武夷山1年生無性系茶苗，茶苗高度33 cm左右，主莖直徑4.1 mm。

試驗采用水培法，將茶苗置于預培養液中培養直至恢復正常生長；恢復生長后的茶苗移至含有不同濃度Cu離子的溶液中進行Cu脅迫；脅迫結束后收集水培茶樹的新根和1芽2葉，一部分用于測定茶樹根、葉組織生理指標（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性），另一部分用于測定茶樹不同組織亞細胞Cu含量。

1.2 茶苗的預培養

茶苗水培營養液配方[18]為：NH4+30 mg/L、NO3-10 mg/L、PO43- 32 mg/L、K+39 mg/L、Mg2+24 mg/L、Al3+0.1 mg/L，pH值為5.5。

將取回的茶苗用自來水淋洗清潔植株，清洗完成后用蒸餾水沖洗植株5次，洗凈后的茶苗定植于裝有3 L蒸餾水的黑色塑料盆中（容量5 L），每盆定植8株（每種茶樹30盆），培養7 d后，將蒸餾水倒凈，添加3 L營養液進行恢復培養，培養時間30 d。培養條件為：采用微型氣泵連續供氣，每隔3 h，停止供氣1 h，每天傍晚18：00左右補充水培液至3 L，每7 d更換1次培養液，培養室溫度23～25 ℃，空氣濕度70%～75%，光照度2 000 lx，光照時間10 h（08：00—18：00），預培養時間30 d[19]。預培養結束后，取出茶苗，用蒸餾水反復沖洗茶苗植株，特別是根系位置，除去雜質和根系所帶營養液、無機離子，沖洗后的茶苗置于含Cu溶液中進行Cu脅迫處理。

1.3 茶苗Cu鹽溶液培養

選擇預培養后長勢較為一致的茶苗按上述水培條件進行Cu鹽水溶液試驗，培養液中不添加營養成分。水培液中的Cu鹽質量濃度設定為40、80、120 mg/L，以未添加Cu鹽設為對照（0 mg/L），每個處理設置6個重復，每種茶樹24盆，處理時間30 d。處理結束后，取不同處理下茶樹的根及1芽2葉用于茶樹根、葉組織生理指標（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性）和茶樹不同組織亞細胞Cu含量的測定。

1.4 茶苗組織生理指標測定

取0.5 g茶樹根或葉，加入5 mL預冷提取液（含pH值7.0、濃度為50 mmol/L的磷酸緩沖液和1% PVP），于冰浴條件下研磨勻漿，勻漿離心10 min，轉速為12 000 g，上清液用于SOD、CAT及POD活性測定。參照張志良等的方法[20]，SOD、POD活性采用分光光度法測定，CAT活性采用碘量法進行。

1.5 茶苗組織亞細胞結構分離