保存溫度對黃顙魚肝組織總RNA質量的影響

楊秀榮+王慶容+劉惠茹

摘要：以黃顙魚肝臟為試驗材料，用TRIzol法提取肝臟組織總RNA，將試驗樣品置于不同溫度下保存，在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測RNA的質量。結果顯示：在低溫沒有密封儲存的情況下，RNA保存較長時間，完整性好；-70 ℃下RNA可以保存8個月，-20 ℃下RNA可以保存4個月；在其他溫度條件下，若密封保存，4 ℃下可保存2周，10 ℃下可保存4 d以上，20 ℃下保存3 d時條帶清晰，保存4 d時條帶模糊，30 ℃下保存2.5 d時條帶變得模糊，到3 d時全部降解，40 ℃下保存1 d條帶清晰，保存2 d條帶變得模糊，保存2.5 d時完全降解。此外應注意的是，RNA如果暴露于空氣中，5 h內所有試驗組的RNA大多數降解。

關鍵詞：黃顙魚；肝臟總RNA；保存溫度；RNA完整性

中圖分類號：S917 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0258-03

近年來，分子生物學各項技術無論在醫學方面還是生物學方面的各個領域均得到廣泛應用，高質量的RNA則是其他后續試驗的基礎。如Northern bolt及雜交分析、寡聚（dT）纖維素選擇分離mRNA、cDNA文庫的構建、逆轉錄酶聚合酶鏈式反應（reversetranscriptase-polymerase chain reaction，簡稱RT-PCR）、RNA原位雜交、轉基因材料鑒定、基因克隆及其表達等試驗的成敗，在很大程度上取決于RNA的質量[1]，對于RNA的質量評價，完整性和均一性是其關鍵因素[2]。RNA特殊的單鏈結構導致其自身結構極不穩定，加上周圍環境中廣泛分布RNA酶（RNase）并且難以滅活，導致RNA很容易降解。有些試驗過程中使用RNA的時間跨越度較大，因此確定RNA在不同溫度下能保存的最長時間就尤其重要。關于不同溫度對RNA質量的影響及不同保存溫度下RNA能夠保存的最長時間方面的研究，目前相關報道較少。本試驗以黃顙魚肝組織RNA為試驗材料，研究不同保存溫度對RNA質量的影響，以期為分子生物學研究者日后如何保存RNA提供可行性參考。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

0.5×TBE的配制。將10.8 g Tris、5.5 g硼酸、0.744 g EDTA-Na2溶解于經高溫滅菌的2 000 mL蒸餾水中，充分搖勻，調節pH值至8.0。

瓊脂糖凝膠的制備。取0.7 g瓊脂糖溶解于盛有70 mL 0.5×TBE溶液的藍蓋瓶中，將其放入微波爐中反復加熱3～4次，直至瓊脂糖完全溶解；待膠液冷卻至60 ℃，向其中加入7 μL GoldViewⅠ型核酸染色劑（其中瓊脂糖的比例為1%，核酸染料的比例為0.01%），將膠液倒入事先已清洗干凈、晾干且插入制膠梳子的膠槽之中，等到膠塊冷卻凝固后，即可將梳子拔出，完成用于電泳的瓊脂糖膠塊制作。

1.2 RNA的提取與檢測

1.2.1 TRIzol法提取總RNA[3] 取健康黃顙魚，用剪刀鈍處猛擊其頭部使其昏厥，立即由瀉殖孔剪至鰓蓋后緣，迅速取肝臟組織（50 mg），將所取組織塊放入1.5 mL EP管內并迅速置于液氮中速凍。

向提前滅菌的研缽中倒入液氮以預冷研缽、研缽棒，采用液氮冷凍組織的方法，將組織置于液氮中充分研磨5 min（在研磨過程中要注意及時補充液氮），最終將組織研磨至粉狀。用經高溫消毒的小鑰匙將粉末集中，加入2 000 μL TRIzol試劑以充分破碎細胞組織（按每100 mg組織加入4 000 μL計算），待解凍后轉入2個1.5 mL EP管內，離心5 min（13 000 g，4 ℃）。取900 μL上清液轉至新的1.5 mL EP管中，加入400 μL三氯甲烷，用力振蕩搖勻，室溫靜置5 min，離心15 min（13 000 g，4 ℃）。將上清液合并于新的1.5 mL EP管中，加入400 μL三氯甲烷，用力振蕩搖勻，室溫靜置2～3 min，離心15 min（13 000 g，4 ℃）。取上清液于另1支EP管中，加入等體積異丙醇，輕輕搖勻，冰上靜置15 min，離心15 min（13 000 g，4 ℃）。棄上清，向白色沉淀中加入用 1 000 μL DEPC水配制的75%乙醇清洗沉淀（輕搖混勻），離心5 min（13 000 g，4 ℃），倒掉上清液。真空干燥RNA沉淀，溶解于30 μL DEPC水中。整個總RNA提取過程均在冰上進行，實驗臺經70%乙醇消毒，鐵制試驗器具經200 ℃高溫消毒300 min，塑料器具置于DEPC水中浸泡過夜后高溫滅菌 40 min，試驗步驟嚴格按照規范操作，以防RNA酶污染。

1.2.2 RNA質量檢測 通過瓊脂糖凝膠電泳的方法對各組RNA進行檢測：將膠板沒于0.5×TBE的電泳液中，取5 μL RNA樣品與1 μL 6×載樣緩沖液（loading buffer）混勻后加至點樣孔中，130 V 電壓電泳20 min，此時條帶已接近膠塊中央[4]，將膠塊置于凝膠成像分析儀下觀察并拍照記錄試驗結果。

1.3 RNA的保存

黃顙魚肝組織總RNA保存條件見表1。

2 結果與分析

2.1 RNA的提取

所提RNA通過瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像分析儀下觀察，圖1顯示，所提RNA均出現28S、18S條帶，條帶清晰無拖尾，且28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，接近2 ∶1，說明所提RNA的完整性好。

2.2 不同保存溫度對RNA質量的影響

將不同溫度下保存的RNA樣品通過瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測，電泳結果顯示：儲存在-70 ℃且未放入消毒袋中保存的RNA，8個月后，RNA樣品具有清晰的18S、28S條帶，且28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，說明RNA的完整性良好，降解程度低（圖2-A）。儲存于-20 ℃且未放置于消毒袋中的RNA，即直接與周圍環境接觸，4個月后，RNA樣品具有較為清晰的18S、28S條帶，且28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，證明RNA較完整（圖2-B）。保存于4 ℃下的RNA樣品如果直接與空氣接觸，儲存5 h后，RNA18S、28S條帶幾乎完全消失；如果保存于消毒袋中，14 d后，從圖2-C中可以看到18S、28S條帶，證明RNA完整性較好。10 ℃下儲存的RNA樣品，如果沒有放于消毒袋中，1 h后條帶幾乎全部降解；如果儲存于消毒袋中，經過1、2、3、4、5 h的保存，條帶沒有發生明顯變化，儲存1 d的RNA樣品具有清晰的18S、28S條帶且28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，儲存 3 d 的18S、28S條帶灰度值的比值減小，即已部分發生降解，當儲存5 d時，條帶變得非常模糊，說明RNA大部分已經降解（圖3）。在20、30、40 ℃溫度條件下，RNA如果暴露于空氣之中，儲存1 h后，幾乎不能觀察到條帶，如果保存于消毒袋中，20 ℃保存的RNA在經歷1、2、3、4、5 h后，條帶沒有發生變化，仍具有清晰的18S、28S條帶，保存1、3 d后，條帶仍較為清晰，保存4 d后，RNA條帶開始模糊，即開始發生降解（圖4）。30 ℃ 下保存的RNA在經過1、2、3、4、5 h時，條帶沒有發生明顯變化，保存1 d后條帶較為清晰，保存 2.5 d 時條帶開始模糊，保存3 d時，18S、28S條帶全部消失（圖5）。在40 ℃條件下，RNA在保存1 d時，條帶亮度明顯低于其他溫度下保存的RNA樣品；保存2 d后，18S、28S條帶全部消失（圖6）。

3 討論

3.1 RNA質量的評價標準

RNA的濃度、純度、完整性是評價RNA質量的主要標準[5]。此外，通過比較RT-PCR產物也可以對RNA的質量進行評價，分子雜交放射自顯影檢測也可以對RNA質量進行評價[6]，實時定量PCR法也是RNA質量檢測的方法之一?？赏ㄟ^核酸蛋白測定儀檢測RNA質量濃度及RNA的D260 nm/D280 nm值以確定RNA樣品的純度[7]，如果D260 nm/D280 nm 值在1.8～2.0之間則說明RNA的純度較高；采用RT-PCR法檢驗RNA的質量，因多糖等雜質的污染會在很大程度上抑制RNA的逆轉錄，當RNA不純時，就會導致RNA逆轉錄的失敗，如果RNA的完整性不高，即使有微量的降解也會使mRNA逆轉錄的cDNA長度大大減小，導致RT-PCR的失敗[8]。RNA完整性的測定可通過瓊脂糖凝膠電泳的方法，通過在凝膠成像分析儀下進行分析來完成對RNA完整性的分析鑒定，若RNA具有清晰的18S、28S條帶，且條帶均一無拖尾現象[9]、28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，提示無明顯降解[10]，說明RNA完整性好。本試驗采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性的方法來評價RNA的質量，如果電泳結果顯示RNA樣品具有18S、28S條帶，且條帶清晰無拖尾，此外28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，則說明RNA的完整性好，即降解少。本試驗所采取的瓊脂糖凝膠電泳來檢測RNA質量的方法基本上可以實現對RNA完整性的分析，但是由于試驗過程中專門用于拍攝電泳圖片的相機出現故障，為了記錄試驗結果，采取普通相機拍攝的方法，最終導致試驗結果所顯示的圖片顏色不一致，出現一定的色差。

3.2 影響RNA質量的因素

影響RNA質量的最大因素是RNA本身的單鏈結構，導致其很容易被降解，另外RNA酶分布廣泛，難以滅活，從而極易導致RNA的降解。所以在試驗過程中提高RNA質量最重要的措施就是避免RNA酶的污染[11-12]。本試驗顯示，溫度也是影響RNA質量的1個關鍵因素，不同溫度下儲存RNA的時間相同，溫度越低，RNA的質量變化越緩慢。相同溫度下RNA儲存不同時間，時間越長，RNA的完整性也越低，即隨著時間的增長，RNA也在逐步被降解。

3.3 對分子生物學試驗者的建議

由本研究初步得出結論：儲存RNA時，最重要的是選擇能夠降低RNA酶活性或者除去RNA酶的手段，如果對RNA需要進行長時間的儲存，應選擇-20、-70 ℃的溫度進行保存，如果保存RNA在1周以內，且能夠保證RNA得到良好的密封時，可以選擇于4 ℃進行保存。

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