方斑東風螺腫吻病致病菌分離及中草藥對其的預防效果

梁健+高山+李永仁

摘要：以患腫吻病的方斑東風螺為研究對象，進行致病菌的分離、純化、DNA測序、人工感染等基礎試驗，在此基礎上，應用1種中草藥混合劑對健康東風螺進行腫吻病預防研究。結果表明，方斑東風螺腫吻病病原菌為弗尼斯弧菌（Vibrio furnissii），其96 h半致死濃度為2×108～4×108 CFU/mL；病原菌對于頭孢菌素藥物高度敏感；連續使用 20 mg/L 中草藥對弗氏弧菌具有一定的效果，但效果不顯著。

關鍵詞：方斑東風螺；藥敏試驗；中草藥

中圖分類號： S944.4+9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2016）11-0267-03

方斑東風螺[Babylonia areolata（Link）]，俗稱花螺，屬腹足綱、新腹足目、蛾螺科。該螺生長速度快、喜高溫，食用價值較大，另外其觀賞價值很高，很適合制作各種水族景觀，混合搭配其他景物可以美化造景。由于人工育苗及養殖技術的突破，海南、廣東、福建等地工廠化觀賞養殖規模日益擴大，尤其在海南省形成了較大的觀賞養殖規模，現有觀賞養殖水池面積約30萬m2，產值超過2億元人民幣[1-2]。隨著方斑東風螺養殖產業的發展，養殖密度越來越大，養殖過程中各種病害也逐漸增多，且日趨嚴重。已有聚縮蟲、纖毛蟲、橈足類和單孢子蟲等寄生蟲病報道[3-7]，近年來出現比較嚴重的病害——吻管水腫病，經常導致方斑東風螺大規模死亡[8]，引起學者們深入研究。目前，已報道引發該病的致病菌有哈維弧菌（Vibrio harveyi）[9-10]、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[11]、鰻弧菌生物變種Ⅰ（Vibrio anguillarum biovar Ⅰ）[12]等。這些研究主要集中在海南、廣東等南方地區，對于北方養殖的方斑東風螺患腫吻病尚無研究報道，更無防治方法的研究。本研究以天津地區養殖場中患腫吻病的方斑東風螺為研究對象，進行了病原菌鑒定及防治方法的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年，天津市海升水產養殖有限公司的方斑東風螺養殖車間暴發腫吻病，主要表現為吻管水腫、顏色發紅，吻管伸出后無法收縮回殼內，無法攝食，病螺停留在沙層表面無法下潛，不久后死亡。本試驗選取患病癥狀明顯且基本一致的個體進行致病菌分離試驗，平均殼長為（16.4±0.8） mm。取其他正常的養殖池中健康個體作為受感染個體，在試驗室內暫養3 d，暫養期間無死亡，養殖海水經沙濾并用二氧化氯（1 mg/L）消毒，鹽度2.4%～2.6%，溫度25～28 ℃。

1.2 致病菌的分離

取病螺外套膜、鰓和內臟團，冰水中進行勻漿，用滅菌海水稀釋一定倍數后涂于Zobell 2216E培養基、胰胨大豆胨肉湯培養基（TSA）、海洋弧菌選擇性培養基（TCBS）上。28 ℃培養24 h，選取菌落形態特征較一致的優勢菌群劃線純化，直到培養基上出現單菌落后，接種于斜面培養基待用。

1.3 人工感染試驗

分離出A、B 2株細菌，進行人工感染試驗。設置A、B菌液濃度為3×108、3×107、3×106 CFU/mL，采用肌肉注射方式，注射到健康螺腹足基部，注射量為50 μL/個，建立A、B 2個試驗組，每個試驗組注射10個螺，每組設3個平行，并設對照組（注射生理鹽水）。注射后不投餌養殖，觀察96 h內累計死亡量并做記錄。

1.4 致病菌的基因測序和分析

對A、B這2個菌株16S rDNA進行測序，測序結果在NCBI上進行Blast比對分析。

1.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法（K-B法）進行藥物敏感性試驗，每種藥物設置2個重復，根據NCCL標準相關步驟和規定[13]進行試驗。

1.6 不同濃度中草藥混合制劑對東風螺抗病能力的影響

中草藥混合制劑為當歸、白芍、柴胡、澤瀉、黨參、黃芪等按一定比例混合，研磨制成粉末，用開水沏泡，將浸泡液投入20 L塑料箱中（箱底鋪沙，放健康螺50個/箱），設置成中草藥濃度為5、10、15、20 mg/L的4個試驗組，每組設3個重復，并設對照組。每3 d施藥1次，施藥24 h后換水，連續飼養30 d，期間正常投喂餌料。30 d后每組取10個個體，根據人工感染試驗確定的A、B這2個菌株的半致死濃度進行致病菌感染試驗，注射劑量為50 μL/個，記錄各試驗組96 h后死亡個數。

2 結果與分析

2.1 患病個體臨床表現

患病的方斑東風螺首先表現出活動緩慢，攝食量減少或停止攝食，螺停留在沙層表面而無法潛入沙中，吻管伸出體外，顏色發紅、腫脹，無法收縮回殼內，嚴重時腹足也出現腫脹并無法縮回殼中，吻管內會有白色液體出現，對外界刺激沒有反應（圖1）。不久后死亡腐爛、氣味惡臭、破壞水質，并且傳染速度較快，若不進行治療和預防，很快全池都會發病。本病且有發病時間短、傳染力強、致死率高等特點，嚴重危害方斑東風螺的養殖發展。

2.2 致病菌的分離純化

病螺組織勻漿液于Zobell 2216E培養基中分離得到2株優勢細菌，分別命名為A、B菌株，優勢強度A>B。在TSB培養基上28 ℃培養24 h后，菌落淡黃色、圓形，邊緣規則且整齊，表面光滑、濕潤并微微凸起，整個菌落不透明，直徑 1.2～2.5 mm。在TCBS培養基上28 ℃培養24 h后，菌落呈現黃色、圓形，邊緣規則整齊，表面光滑、濕潤、中央微微凸起，菌落不透明，直徑2.0～3.2 mm。

2.3 致病菌的基因測序和分析結果

經NCBI上進行Blast比對，A、B菌株均與弗尼斯弧菌NCTC 11218菌株（GenBank序列號為CP 002377.1）的同源性為99%。

2.4 人工感染試驗

由人工感染試驗結果（圖1）可見，A、B菌株注射濃度為3×108 CFU/mL時，累計死亡率分別為40%、50%，并隨著菌液濃度的降低，死亡率也降低，注射生理鹽水對照組的累計死亡率為0。通過SPSS 17.0線性回歸方程分析得出A菌株的96 h半致死濃度為3.93×108 CFU/mL，B菌株為 2.19×108 CFU/mL（表1）。

對感染后死亡的病螺進行致病菌的再分離，得到單一的優勢菌，菌落形態與之前分離的一致，菌株重新鑒定，結果與受試菌株為同一菌株。

2.5 藥敏試驗結果

由表2可知，病螺提取的A、B病原菌對于頭孢菌素、環丙沙星、慶大霉素、氯霉素、新霉素、呋喃唑酮等藥物敏感，特別是頭孢菌素對其具有較高的抑制作用。而對氨芐西林、林可霉素、萘啶酸、磺胺嘧啶等藥物具有耐藥性。

2.6 中草藥對東風螺抗病能力的影響

由表3可知，人工感染A菌株的試驗中，施用中草藥 20 mg/L 的試驗組96 h后死亡率為36.67%，較其他濃度組略微偏低，但各組之間并無明顯差異。

3 討論

3.1 方斑東風螺腫吻病的病原

對東風螺腫吻病病原的研究已有報道，黃郁蔥等研究發現湛江南山島某東風螺養殖場出現的腫吻病致病菌為哈維氏弧菌[10]；王江勇等從海南省萬寧市山根鎮某工廠化東風螺養殖場暴發的腫吻病病螺體內，分離出的致病菌也為哈維氏弧菌[9]；本試驗所分離出的致病菌為弗氏弧菌，與哈維氏弧菌同為弧菌類細菌。這可能是由南北方地理位置和環境氣候差異導致的。地理隔離和環境差異會導致致病菌的種類發生一定變化，即使同一地區致病菌也會出現不同，例如張新中等從海南某養殖場患腫吻病的螺體中分離的致病菌鑒定為鰻弧菌生物變種（V. anguillarum biovar Ⅰ）[12]。

3.2 東風螺腫吻病的治療措施

弧菌類細菌是海水養殖的主要病原菌[14]，可感染雜色鮑（Haliotis diversicolor）[15]、斜帶石斑魚（Epinephelus coilides）[16]、凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）[4]、大黃魚（Pseudosciaena crocea）[18]等?；【秩舅a動物的主要方式是通過皮膚、消化道等器官的傷口或直接進行感染[19-20]。養殖過程中出現腫吻病沒有任何前兆，若白天有部分螺體停留在沙層表面不潛入沙中，則2～3 d后沙層表面會有大量螺體出現，且行動緩慢、吻管伸出、對外界刺激不作反應，3～5 d后開始死亡。由此可見，該病可以通過接觸途徑直接傳播，且傳播迅速。本試驗對致病菌的藥敏試驗結果顯示，頭孢菌素對弗氏弧菌具有較強的抑制作用，而其對磺胺類藥物具有一定的耐藥性。這說明弗氏弧菌只對部分抗生素敏感，因此在以后的生產過程中，應選用頭孢菌素這類對弧菌具有良好抑制作用的藥物，防止濫用藥物而導致致病菌出現抗藥性，以及破壞養殖水體中的微生態環境。

3.3 東風螺腫吻病的預防措施

以當歸、白芍、柴胡、澤瀉、黨參、黃芪等中草藥按一定比例混合并研磨制成粉末，試驗其對東風螺腫吻病預防效果。與對照組相比，不同施藥濃度對人工感染后的死亡率影響不大，但在20 mg/L施用濃度下，感染A、B這2個菌株的東風螺的累計死亡率均為最低，對弗氏弧菌引起的腫吻病具有一定的效果，但不顯著。通過調整中草藥種類、配伍比例，有望開發出有效提高方斑東風螺對腫吻病抵抗力的藥物，為東風螺在北方的養殖推廣提供一定幫助。

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