氣腫疽梭菌膠體金診斷試紙條的研制

任春宇+姜丹丹+車達

摘要：為建立快速、準確、簡便的檢測氣腫疽的膠體金免疫層析試紙條，以免疫層析法為指導，根據抗原-抗體的特性，建立了不需要再加入任何檢測試劑且快速簡便的檢測方法。結果表明，膠體金與該單抗的最佳結合量為 30 μg/mL，最佳 pH 值為8.4，最佳NC膜為Millipore HFB1350220型。將純化的氣腫疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG分別以1 ∶4和1 ∶8的稀釋倍數噴于硝酸纖維素膜的T線和C線。對膠體金診斷試紙條進行驗證，敏感度高，可檢測到的最低抗原量為1×105 CFU/mL，特異性強、無假陽性與交叉反應現象、有較好的穩定性。本研究旨在建立快速、準確、簡便的檢測氣腫疽的膠體金免疫層析試紙條。

關鍵詞：氣腫疽梭菌；膠體金；免疫層析試紙條

中圖分類號： S855.1+2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0283-03

氣腫疽又稱黑腿病或鳴疽，是由氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的反芻動物的急性、敗血性傳染病[1]。該菌屬細菌綱芽孢桿菌科梭菌屬，是土壤中的專性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，經常發現于牛和綿羊的腸內容物中[2]，特別在深部傷口的厭氧環境中[3-4]。該菌為革蘭氏陽性棒狀大桿菌，對進行疫苗接種的豚鼠腹腔滲出液做涂片觀察，可發現該菌以單個形式存在，或幾個細菌形成短鏈，可與呈長鏈的腐敗梭菌做出鑒別，這是形態上的主要區別之一[5]。在進行菌體培養時，需創造嚴格的厭氧環境，尤其是在固體培養中，當接種于葡萄糖血液瓊脂中時，形成半透明圓形菌落、β溶血環，中心略凸起[6]。

該菌繁菌體的抵抗力不強，但芽孢卻有很強的抵抗力，可在土壤中存活多年[7]，在腐敗尸體中仍可存活3個月。若想將組織內的芽孢殺死，經煮沸20 min或0.2%升汞處理 10 min 方可。一旦通過深部創傷或術后而感染[8]，或經口感染，經胃腸道腸系膜進入血液最終到達各個器官和肌肉組織內的芽孢將迅速繁殖[9]，并很快出現病癥，還可形成腸氣腫疽，易感動物在感染后12～36 h則出現死亡[10]。

本試驗選用氣腫疽梭菌標準株制備菌體單克隆抗體，旨在將該單抗與膠體金標記結合，研制出能對氣腫疽梭菌做出快速診斷的膠體金免疫層析試紙條，該試紙條研制成功將為氣腫疽診斷、流行病學調查及衛生檢疫等提供快速、簡便、準確的檢測手段，更好地應用于生產實踐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

氣腫疽梭菌標準株C54-1，購自于中國獸醫藥品監察所；氯金酸（HAuCl4·4H2O），購自科興生物科技有限公司；檸檬酸三鈉C6H5Na3O7·2H2O，購自北京華力德科技有限公司；二氯二甲基硅烷（Sigma公司產品）；PVC底板、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、MAX線標簽貼紙、色皮標簽等，購自杭州隆基生物技術有限公司；BSA，購自Promega公司；樣品墊及吸水墊，購自上海金標生物科技有限公司。

1.2 單克隆抗體的制備、純化及檢測

注射經離心洗滌的雜交瘤細胞于8周齡BALB/c小鼠，待有腹水形成后，取腹水并用間接ELISA法檢測腹水效價。采用Protein A 親和層析法對單克隆抗體進行純化，用紫外光分光光度計測量純化的單抗濃度，將單抗溶液做50倍稀釋，分別于260 nm 和280 nm 波長下測吸光度，并于-20 ℃儲存備用。

1.3 膠體金的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，制備膠體金粒徑大小為20～25 nm。將100 mL去離子水和1 mL 1%氯金酸溶液加入硅化處理好的錐形瓶中，加熱至完全沸騰時，迅速加入1.5 mL 1%檸檬酸三鈉，煮沸5～10 min，發現溶液顏色漸變成酒紅色后，繼續煮沸10 min取下，置于常溫自然涼透，補足水分，4 ℃保存備用。

1.4 金標的制備

1.4.1 氣腫疽梭菌單抗與膠體金顆粒結合的最適pH值確定

將制備的膠體金加入若干2 mL離心管中，1.5 mL/管。將pH值分別調為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。按pH值從低到高分別加50 μL 1 mg/mL 的單抗IgG到離心管中，搖勻30 min后靜置約10 min；再將100 μL的10% NaCl溶液加至管中，搖勻20 min后靜置約1 h，觀察顏色變化情況，記錄能保持為紅色的最低pH值，即為最適pH值。

1.4.2 單克隆抗體最適用量的確定

分別取金標用抗體5、10、15、20、25、30、35、40、45 μg，加入1 mL膠體金溶液中充分混勻，完成后室溫靜置約1 h，觀察膠體金溶液的顏色變化。

1.4.3 膠體金探針的制備

取已制備好的膠體金溶液 20 mL 加入50 mL離心管中，將膠體金溶液的pH值調整為略高于最適pH值0.2～0.4，在磁力加熱攪拌器運行中，將純化后的單克隆抗體溶液按最佳結合濃度緩慢滴入膠體金溶液中，混勻后室溫靜置10 min，再置于磁力攪拌器上加入終濃度為2%的BSA，離心棄上清，用TBS將沉淀溶解，即為合成探針。

1.4.4 膠體金探針的純化

先除去其中未被完全標記的膠體金和在標記的過程中容易產生的多種聚合物[11]。應用低溫高速離心純化方法，將標記好的膠體金先以小轉數離心；再將收集的上清液以13 500 r/min離心1 h，此時將上清液緩慢倒出。將沉淀以原體積的膠體金重懸液溶解沉淀，低溫重復離心2～3次，沉淀溶于原體積的膠體金重懸液中，4 ℃保存備用。

1.5 試紙條的制備

1.5.1 金標墊的制備

在金標墊處理液Ⅰ與Ⅱ中分別處理玻璃纖維素膜GF-08和Ahlstrom 8964，1 h后取出并于常溫中晾干，干燥保存。玻璃纖維素膜處理完畢后剪成50 mm寬的長條，把制備好的金標探針按一定量均勻噴涂于玻璃纖維上，選出最佳玻璃纖維膜及處理液。

1.5.2 樣品墊的預處理

將樣品墊裁剪成適當尺寸浸入預處理液中浸泡20 min取出，控干液體，置烘干箱，烘干后干燥保存。

1.5.3 NC膜的優選

選擇不同流速的Millipore HFB1350220、whatman Immunopore RP、whatman Immunopore FP、Sartorius CN 140、whatman AE 99 （無背襯）硝酸纖維素膜于處理液中，浸泡30 min取出，用PBS沖洗，烘干。進行流速試驗，注意其流速和反應背景均勻度，選擇層析速度快（3～5 min）且背影小、顏色淡的硝酸纖維膜。

1.5.4 T線及C線條件的優化

將純化處理好的兔抗氣腫疽梭菌血清及羊抗鼠IgG分別按以下比例稀釋：1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32。然后劃在NC膜的檢測線和質控線上進行優化（做方陣試驗），選出效果最好的一組進行包被。

1.5.5 封閉液的優化

將噴涂有腫疽梭菌多抗及羊抗鼠IgG的NC膜分別置于5%犢牛血清、3%脫脂乳和1%BSA中，在封閉液中浸泡30 min，取出用PBS沖洗，晾干，制成試紙條，用標準陽性和陰性血清作試驗，篩選出最佳封閉液。

1.5.6 試紙條的組裝

將硝酸纖維素膜貼在PVC底板中央，貼后不要有空隙和氣泡；金標結合墊平貼于NC膜T線下方壓住 NC 膜重疊5 mm、然后粘貼樣品板及吸水紙，小心抹平，最后貼上MAX線標貼和色皮標簽，即成檢測試紙條。

1.6 試紙條的檢測方法和結果判定

使試紙條保持豎直方向，將樣品墊端放入稀釋后的待檢樣液中（注意液面不可超過MAX 線），室溫下作用5～10 min，觀察結果。

1.7 敏感性試驗

將氣腫疽梭菌菌液做1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400倍比稀釋，分別將試紙條插入以上不同稀釋度的菌液中，觀察結果。

1.8 特異性試驗

用膠體金試紙條檢測選取與氣腫疽梭菌種系相近的腐敗梭菌、肉毒梭菌進行特異性試驗，觀察檢測結果是否存在交叉反應。

1.9 重復性試驗

隨機取40支試紙條進行檢測試驗，10只進行陰性樣品檢測，30支進行陽性樣品檢測，測定試紙條的重復性。

1.10 穩定性試驗

將膠體金試紙條置于室溫和4 ℃冰箱中保存，半年內檢測1次/月保存的陽性菌液及陰性對照菌液，觀察檢測結果，比較符合率。

2 結果與分析

2.1 單克隆抗體的制備、純化及檢測

全菌加強免疫后收集血清，經辛酸-硫酸銨法進行抗體的粗提，并透析除鹽處理后，以間接ELISA法檢測多抗效價，氣腫疽梭菌的抗體效價為1 ∶25 600。

經辛酸-硫酸銨法粗提，再用Protein A 親和層析法純化，間接ELISA法測定的單克隆抗體效價為1 ∶102 400，抗體效價升高1倍。測得純化蛋白的濃度為28.14 mg/mL（紫外分光度計測定）。

2.2 單克隆抗體與膠體金結合的最佳pH值確定

將膠體金溶液的pH值分別調為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。按pH值從低到高分別加50 μL 1 mg/mL 單抗IgG和100 μL 10% NaCl溶液至膠體金管中，振搖20 min，室溫下靜置1 h。根據膠體金的顏色變化，確定了最低pH值為8，再做pH值為7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8幾個梯度，室溫下放置2 h，觀測膠體金顏色變化，記錄仍保持紅色的pH值，穩定膠體金的最適pH值為8.4。

2.3 膠體金標記單克隆抗體最適用量的確定

將膠體金顆粒與氣腫疽梭菌單克隆抗體進行標記。觀察膠體金溶液的顏色變化，穩定膠體金所需抗體的最低量為 25 μg，而實際標記中使用免疫金抗體的量為最低量再加20%，即為30 μg，確定單克隆抗體與膠體金的的最佳結合濃度應為30 μg/mL。

2.4 金標墊的制備

將已經純化好的金標探針按一定量均勻噴涂于玻璃纖維上，于室溫干燥后觀察顏色和均勻度。比較結果為浸泡在金標墊處理液Ⅱ中的Ahlstrom 8964玻璃纖維干燥后的顏色（酒紅色）與純化后的免疫膠體金顏色相同，且均勻度最好；檢測樣品時，玻璃纖維上的膠體金探針被溶解并帶動其向前移動，釋放效果最好。所以本試驗選用Ahlstrom8964玻璃纖維膜（經金標處理液Ⅱ處理的）為金標墊。

2.5 不同型號NC膜的選擇結果

選擇5種不同型號的NC膜，用NC 膜處理液于37 ℃浸泡30 min。做流速試驗，Millipore HFB1350220型NC膜所用的時間最短，僅為4 min，且擴散均勻不拖帶。因此，選擇該型號的硝酸纖維素膜作為免疫層析載體膜。

2.6 T線及C線的優化結果

氣腫疽梭菌多抗進行1 ∶4倍稀釋時，效果較好（顏色清晰且無拖帶現象），以1 ∶4稀釋后噴于T線；羊抗鼠IgG做 1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8稀釋時，均能得到理想效果。將羊抗鼠IgG作1 ∶8稀釋后噴在C線上；按2.0 μL/cm的噴膜量進行噴膜可達到較好結果，免疫層析顯色較快，顏色深且清晰可辨，顯色條帶無中空效果。

2.7 試紙條的組裝和判定

檢測樣品溶液，在5～10 min內觀察檢測結果，根據出現紅色反應線的情況確定待檢樣液的陰性、陽性，若出現2條紅色反應線則為陽性反應，只出現質控線上1條紅線為陰性反應，均不顯紅色線則試紙條無效（圖1）。

2.8 敏感性試驗

將氣腫疽梭菌菌液做1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400倍稀釋，結果顯示氣腫疽梭菌菌液稀釋至1 ∶100倍時，結果仍顯示為陽性，檢測到的菌液最低抗原量為1×105 CFU/mL。

2.9 特異性試驗

用膠體金試紙條檢測氣腫疽梭菌（C54-1）、腐敗梭菌、肉毒梭菌。檢測結果顯示，氣腫疽梭菌呈陽性，試紙條無假陽性與交叉反應現象（圖2）。

2.10 重復性試驗

10條試紙條進行陰性樣品檢測結果顯示，T線均不出條帶，9條試紙條C線顯現深紅色帶，1條的C線為淺紅色帶；檢測陽性樣品的30條試紙條，T線C線均出現紅色條帶，由此得出試紙條的重復性達到100%，重復性好。

2.11 穩定性試驗

將試紙條密封后于室溫和4 ℃環境存放，5個月內均能正常穩定顯色，室溫環境中于5個月后略出現膠體金探針釋放不完全的現象，4 ℃條件下放置的試紙條在6個月后才出現上述現象，但特異性無變化。

3 討論

膠體金是氯金酸的水溶膠，可以結合多種生物大分子，現已成為在免疫標記技術中1種常用的非放射性示蹤劑。在1971年，Faulk和Taylor首次將膠體金顆粒用抗體來標記，在免疫化學領域中誕生了1項新技術[12]。與ELISA法相比，除了都具有較強的特異性和敏感性之外，在操作上也更加簡便快速，無需復雜儀器設備且極易判斷，保質期長。隨著試劑盒品種和銷售量的不斷增長，現已發展為生產完全自動化和標準化水平。

膠體金顆粒質量除了受水質、試劑純度等多種因素的影響之外，還與檸檬酸鈉的加入以及攪拌的程度和加入速度有關。制備膠體金溶液玻璃器皿的清潔是成功制備膠體金的前提條件[13]。由膠體金的性質可知，膠體金具有不穩定性，有聚沉的可能，故制備好后盡量在20 d以內進行標記[14]，不可長時間放置。在膠體金診斷試紙條的研制過程中，需要對一系列反應條件和材料進行優化和篩選。固相蛋白與NC膜的結合是重中之重，是否能獲得靈敏度高、重復性好的檢測結果取決于蛋白與膜的結合效果。蛋白與膜的結合力主要為疏水作用力、氫鍵和靜電吸引力，所以在優化蛋白結合膜時應當考慮到這幾種力的作用，選擇不會使疏水作用力和靜電引力下降的緩沖液，使之不影響蛋白結合力。噴完抗體后對NC膜做適當的干燥，使蛋白能夠長期而穩定地與膜結合。本試驗應用雙抗體夾心法，將氣腫疽梭菌多抗包被在檢測線處，羊抗鼠IgG包被在質控線處，金標單克隆抗體吸附在纖維素膜固相載體上來裝備試紙條，檢測樣品中的抗原。當待檢樣液中有氣腫疽梭菌（C.chauvoei）時，形成“金標單抗-C.chauvoei”復合物，由于毛細虹吸作用，該復合物以及未結合的金標單抗往上走，在檢測線上形成“金標單抗-C.chauvoei-多抗”復合物，因有金顆粒在此沉積，故出現肉眼可見紅色條帶，未結合的金標單抗繼續上行，與控制線上的羊抗鼠IgG結合，又形成1條紅色條帶；若待檢樣液中不含C.chauvoei，則只出現1條紅色條帶，只在試紙條上端的C線上出現紅色沉淀線。試驗證明該試紙條的檢測不僅耗時短、操作簡單、靈敏度高，而且成本較低，適用于氣腫疽的現場檢測及鑒別診斷，可以在實踐中推廣使用。

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