弗氏檸檬酸桿菌SYBRGreenⅠ熒光定量PCR診斷方法的建立及耐藥性分析

王芳+康超+李永霞

摘要：根據(jù)GenBank中弗氏檸檬酸桿菌ompA基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增弗氏檸檬酸桿菌ompA基因片段，T克隆到pMD-18T載體上構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒。通過SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，建立弗氏檸檬酸桿菌SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR診斷方法，結(jié)果顯示重復(fù)性好、特異性高，靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝/μL，說明建立的弗氏檸檬酸桿菌SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法適合于弗氏檸檬酸桿菌病臨床疑似病料樣品的快速診斷。對(duì)分離得到的83株弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明冷水魚養(yǎng)殖中耐藥性問題日益嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞：弗氏檸檬酸桿菌；熒光定量PCR；快速診斷；耐藥性

中圖分類號(hào)： S855.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0286-04

弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）是革蘭氏陰性菌、短桿菌，該菌在水體、土壤中廣泛存在，是一種條件致病菌，可引起人、畜、魚類的敗血癥[1-3]。近幾年，貴州省冷水魚的養(yǎng)殖發(fā)展迅速，主要品種有虹鱒、金鱒、斑點(diǎn)鱒鮭、鱘魚、大鯢。隨著冷水魚養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）集約化程度不斷提高，苗種流通交換量不斷加大，病害逐漸增多，病情不斷愈趨復(fù)雜。目前，弗氏檸檬酸桿菌感染的病害報(bào)道主要集中在鱘魚、蝦、中華鱉，而鱒鮭魚、大鯢報(bào)道較少。感染該菌的鱘魚、蝦、中華鱉、鱒鮭魚和大鯢出現(xiàn)消化不良或拒食，頭部、腹部腫大，輕度腹水，皮下有出血點(diǎn)等癥狀[4-7]。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)，不能快速、準(zhǔn)確地得到鑒定結(jié)果。熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行疾病病原菌的鑒定和診斷，較普通PCR反應(yīng)程序快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果簡(jiǎn)單可視。本研究根據(jù)GenBank中弗氏檸檬酸桿菌ompA序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增出ompA基因片段，克隆到pMD-18T載體上，構(gòu)建陽性標(biāo)準(zhǔn)品。通過對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立弗氏檸檬酸桿菌的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR診斷方法，以期對(duì)弗氏檸檬酸桿菌臨床疑似病樣進(jìn)行快速檢測(cè)和診斷。同時(shí)，對(duì)冷水魚養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到的弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行耐藥性分析，為探討防治弗氏檸檬酸桿菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株包括弗氏檸檬酸桿菌、致病性嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、黃桿菌、遲緩愛德華菌，由貴州重大疫病監(jiān)測(cè)防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑包括普通PCR酶、SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR酶、核酸染料Goldview、1×TAE電泳緩沖液、DL2000、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PBS緩沖液等、pMD-18T連接載體，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；藥敏試紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中弗氏檸檬酸桿菌ompA序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物為5′-CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3′，下游引物為5′-TCTGGGGTCTCCTTCGTAAATGC-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為117 bp，引物為生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 核酸的提取

1.2.2.1 組織樣品 取患病冷水魚肝臟組織約2.0 g，加入0.1 mol/L PBS緩沖液5 mL進(jìn)行研磨，然后置于-70 ℃低溫冰箱中反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心5 min，取上清液 970 μL 加入10% SDS 20 μL，20 mg/mL蛋白酶K 10 μL，55 ℃ 孵育30 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液200 μL，用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取基因組。

1.2.2.2 細(xì)菌樣品 細(xì)菌樣品DNA的提取參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 pMD-18T- fre陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 通過PCR擴(kuò)增獲得弗氏檸檬酸桿菌ompA基因片段，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA片段，與pMD-18T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，重組體命名為pMD-18T-fre，同時(shí)送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD-18T-fre在260、280 nm處的吸光度，得到重組質(zhì)粒的濃度和純度，進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL，對(duì)退火溫度在50、55、60 ℃等3個(gè)溫度上進(jìn)行優(yōu)化，引物濃度在5、10、20 μmol/L等3個(gè)濃度上進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件。反應(yīng)體系為：上下游引物各1 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，模板 1 μL，用超純水補(bǔ)足至25 μL，同時(shí)以超純水作為空白對(duì)照。反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 s；94 ℃ 10 s，退火溫度（50、55、60 ℃）10 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定pMD-18T-fre質(zhì)粒，計(jì)算出濃度、純度和DNA拷貝數(shù)，將標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，以“1.2.4”節(jié)下優(yōu)化好的條件進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)，以核酸拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 將10倍倍比稀釋后的pMD-18T-fre質(zhì)粒分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)稀釋倍數(shù)3次重復(fù)，以研究建立的熒光定量PCR診斷的敏感性。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 分別以弗氏檸檬酸桿菌、致病性嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、黃桿菌、遲緩愛德華菌DNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每種細(xì)菌DNA 3次重復(fù)，以研究建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法重復(fù)檢測(cè)弗氏檸檬酸桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品3次，以研究檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

1.2.9 建立的熒光定量PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)2013年1月至2015年5月貴州省貴陽市、黔西南、銅仁地區(qū)幾個(gè)規(guī)模化鱒鮭魚、大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)以及散養(yǎng)戶采集的356份疑似鱒鮭魚、大鯢病料（肝臟），135份大鯢餌料魚病料，184份發(fā)病鱒鮭魚、大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)水樣，應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)。

1.2.10 弗氏檸檬酸桿菌的耐藥性分析 對(duì)2013年1月至2015年5月貴州省貴陽市、黔西南、銅仁地區(qū)幾個(gè)規(guī)模化冷水魚養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到的弗氏檸檬酸桿菌運(yùn)用藥敏紙片法檢測(cè)分離菌對(duì)18種抗生素藥物的敏感性，藥敏試紙片包括青霉素、氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢拉定、頭孢唑林、鏈霉素、慶大霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、紅霉素、利福平、呋喃唑酮、卡那霉素、土霉素、林可霉素、磺胺二甲嘧啶鈉。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD-18T-fre陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

擴(kuò)增的弗氏檸檬酸桿菌ompA片段大小為117 bp，無非特異性片段產(chǎn)生（圖1）。將生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序結(jié)果與GenBank中的ompA基因序列進(jìn)行比對(duì)，核苷酸相似度為98.9%～100.0%。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，在25 μL反應(yīng)體系中，最佳反應(yīng)條件為Premix Ex Taq 12.5 μL、ROX Reference Dye 0.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、模板2 μL、超純水8 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 s；94 ℃ 10 s，退火溫度55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

2.3 熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

將標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別取1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），線性回歸方程為Ct=-2.980×lg（核酸拷貝數(shù)）+9.27（r2=0.999）。

2.4 熔解曲線分析

擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度Tm為84.6～85.4 ℃，無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物等峰值出現(xiàn)（圖3）。

2.5 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別取1.0×100、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105拷貝/μL重組質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖4）顯示其靈敏度為1.0×101拷貝/μL。

2.6 特異性試驗(yàn)

以弗氏檸檬酸桿菌、致病性嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、黃桿菌、遲緩愛德華菌DNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)菌株進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果顯示弗氏檸檬酸桿菌為陽性，而致病性嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、黃桿菌、遲緩愛德華菌為陰性（圖5）。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)弗氏檸檬酸桿菌DNA，樣品重復(fù)3次，以檢驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，結(jié)果均一致。

2.8 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)采集的356份鱒鮭魚、大鯢病料（肝臟）弗氏檸檬酸桿菌陽性率為26.4%（94/356），135份大鯢餌料魚病料陽性率為 11.1%（15/135），64份發(fā)病鱒鮭魚、大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)水樣陽性率20.3%（13/64）。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定356份鱒鮭魚、大鯢病料（肝臟）弗氏檸檬酸桿菌陽性率為19.1%（68/356），135份大鯢餌料魚病料陽性率為7.4%（10/135），64份發(fā)病鱒鮭魚、大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)水樣陽性率7.8%（5/64）。熒光定量PCR方法敏感性均高于傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定。

2.9 弗氏檸檬酸桿菌的耐藥性分析

將2013年1月至2015年5月貴州省貴陽市、黔西南、銅仁地區(qū)幾個(gè)規(guī)模化冷水魚養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到83株弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

3 結(jié)論與討論

目前，臨床常用的病原菌鑒定方法主要有傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)及生化鑒定。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，基于SYBR GreenⅠ的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，適合于臨床樣品的快速診斷。余波等利用傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)合PCR測(cè)序?qū)Υ篥F細(xì)菌性敗血癥病原進(jìn)行分離鑒定，從對(duì)病原菌分離、培養(yǎng)、純化，到生化鑒定整個(gè)過程最快需要1周[8]。胡秀彩等采用弗氏檸檬酸桿菌16S rDNA V3區(qū)的PCR-SSCP圖譜進(jìn)行菌株鑒別效果良好[9]。余波等研制的致病性嗜水氣單胞菌 SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒具有特異、靈敏、快速等特點(diǎn)，敏感度達(dá)到1.0×101拷貝/μL[10]。本研究根據(jù)GenBank中弗氏檸檬酸桿菌ompA基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，PCR擴(kuò)增獲得ompA基因片段，將其克隆到pMD-18T載體上構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品陽性質(zhì)粒。通過SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立弗氏檸檬酸桿菌SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR診斷方法，靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝/μL。傳統(tǒng)細(xì)菌分離和熒光定量均能檢測(cè)到養(yǎng)殖用水和餌料魚中存在弗氏檸檬酸桿菌，表明該菌是在冷水魚養(yǎng)殖中廣泛存在的，當(dāng)養(yǎng)殖密度提高以及鱒鮭魚、大鯢大鯢免疫力下降時(shí)就容易發(fā)病。因此，控制好水質(zhì)、餌料，提高冷水魚自身的免疫力，對(duì)弗氏檸檬酸桿菌的防治至關(guān)重要。

目前，弗氏檸檬酸桿菌的耐藥性報(bào)道較少，Chuang等報(bào)道了弗氏檸檬酸桿菌對(duì)頭孢噻肟耐藥性[11]，Nawaz等報(bào)道了耐四環(huán)素的弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定[12]。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離得到的83株弗氏檸檬酸桿菌對(duì)目前應(yīng)用較為廣泛的青霉素、鏈霉素、土霉素等產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，僅頭孢類和氟苯尼考敏感，說明目前在冷水魚養(yǎng)殖中耐藥性問題也較嚴(yán)重，抗生素的濫用在冷水魚上要引起重視。

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